Липополисахарид (ЛПС) и эндотоксины: структура, иммунологическая роль и методы контроля в биотехнологии

Липополисахарид (ЛПС, эндотоксин) представляет собой крупную молекулу, которая состоит из жиров и сахаров. Эта молекула — главный компонент внешней мембраны клеточной стенки грамотрицательных бактерий, которые выступают сильнейшим активатором врожденного иммунитета человека. При попадании бактерий в организм рецепторы иммунных клеток распознают именно ЛПС как чужеродный объект и тут же запускают защитную реакцию для борьбы с инфекцией.

В этой статье мы разберем структуру эндотоксинов и их влияние на иммунный ответ. Также рассмотрим проблемы, которые возникают при очистке белков и антител, и современные методы количественного определения липополисахаридов (ЛПС).

Химическая структура ЛПС: липид А, коровой олигосахарид и О-антиген

Молекула липополисахарида (ЛПС) состоит из 3 компонентов. Причем они последовательно связаны друг с другом.

• Липид А. Выступает своеобразным «якорем», который удерживает молекулу ЛПС в бактериальной мембране. Очень токсичный. При разрушении бактерий липид А высвобождается и поступает в кровоток, что вызывает тяжелые воспалительные реакции, жар и септический шок.
• Коровой (центральный) олигасахарид. Выполняет роль связующего звена, соединяя токсичный липид А с внешним О-антигеном. Обычно состоит из цепочки в 8–12 углеводных остатков, которая делится на два участка: внутренний кор и внешний кор. Нарушение в синтезе коровой части может привести к гибели бактериальной клетки.
• О-антиген. Находится на поверхности бактериальной клетки. Главная функция — защита от внешних воздействий и атак вирусов-бактериофагов. Именно О-антиген вызывает сильный иммунный ответ, заставляя организм вырабатывать специфические антитела.

ЛПС как эндотоксин: механизм взаимодействия с рецептором TLR4

Липополисахарид (ЛПС) часто называют эндотоксином. По сути, это равнозначные обозначения. Приставка «эндо» означает «внутри». То есть токсин сидит внутри клеточной стенки и выходит наружу только в том случае, когда бактерия погибает или повреждается. Это отличает его от экзотоксинов, которые бактерии выделяют в процессе жизни.

Попадая в организм человека, ЛПС высвобождается и оказывает токсичное воздействие, что запускает мощный иммунный ответ через TLR4 рецептор. Сам процесс требует участия вспомогательных белков и протекает в несколько этапов.

Метаболический путь взаимодействия липополисахаридов (ЛПС) и TLR4:

• Липополисахарид-связывающий белок (LBP) находит и крепко захватывает ЛПС, после чего переносит его и передает специальному белку CD14, который находится на поверхности клеток нашей иммунной системы и помогает организму распознавать бактерии.
• Белок CD14 концентрирует ЛПС для облегчения последующей передачи и переносит его на белок MD-2, соединенный с Toll-подобным рецептором 4 (TLR4 рецептор) в единый комплекс.
• ЛПС связывается с внеклеточным белком MD-2. Часть молекулы погружается внутрь кармана MD-2.
• ЛПС, MD-2 и TLR4 соединяются вместе, образуя димер.
• TLR4 рецептор дает клетке сигнал о заражении, что вызывает воспалительную реакцию для борьбы с грамотрицательной бактерией.

Проблема эндотоксинов в производстве рекомбинантных белков и антител

Рекомбинантные белки — это искусственно созданные белки, которые используют при проведении иммуноферментного анализа и других лабораторных исследований для безопасности. Ученые берут необходимый ген и встраивают его в ДНК клетки-хозяина, после чего она начинает производить нужный белок по чужой инструкции. Часто в этом процессе задействованы грамотрицательные бактерии — они просты в устройстве, дешевые и очень быстро размножаются.

И вот тут как раз возникают две критические проблемы. Липополисахариды (ЛПС), которые являются главными компонентами внешней мембраны грамотрицательных бактерий, оказывают сильное токсичное воздействие на живые организмы, что создает угрозу безопасности. А вторая проблема связана с техническими сложностями при удалении эндотоксинов для устранения этой угрозы.

При производстве рекомбинантных белков липополисахарид (ЛПС) высвобождается в раствор. Однако из-за физико-химических свойств он прочно связан со многими белками. Поэтому отделить его довольно сложно. Даже в следовых количествах ЛПС вызывает мощный иммунный ответ. Кроме этого, он дает ложноположительный результат при исследованиях — воспалительный ответ клеток на эндотоксин воспринимается за действие самого белка.

При производстве антител для иммуноферментного анализа сталкиваются с такой же проблемой. Липополисахарид (ЛПС) делает конечный продукт опасным для жизни. Попадание в организм антител со следами эндотоксинов вызывает иммунный шок.

Проблему с ЛПС решают с помощью глубокой очистки белков. Существует несколько методов удаления эндотоксинов:

• Ионообменная хроматография (ИОХ). Разделение основано на различиях в заряде молекул. Для удаления ЛПС часто используют анионообменные сорбенты, так как ЛПС несет отрицательный заряд. Эффективность зависит от pH, ионной силы, проводимости буфера, заряда целевого белка и агрегационного состояния ЛПС.
• Гидрофобная хроматография (ГХ). Разделение основано на различиях в гидрофобности. Метод может использоваться для удаления ЛПС благодаря гидрофобной части липида A, но требует подбора буфера, ионной силы и условий, предотвращающих потерю или агрегацию целевого белка.
• Аффинная хроматография. Может применяться как для очистки целевого белка, так и для удаления эндотоксина. Для удаления ЛПС используют сорбенты с лигандами к липиду A, например полимиксин B. При использовании таких сорбентов необходимо контролировать возможный вынос лиганда и валидировать удаление эндотоксина.
• Двухфазная экстракция тритоном X-114. Метод основан на разделении раствора на водную и детергентную фазы. ЛПС преимущественно переходит в детергентную фазу, а белок может остаться в водной. Метод подходит не для всех белков и требует последующего удаления детергента.
• Ультрафильтрация и диафильтрация. Могут использоваться как вспомогательные методы, если размер целевого белка и форма ЛПС позволяют разделить их по молекулярной массе. Эффективность зависит от агрегации ЛПС, взаимодействия ЛПС с белком и выбора мембраны. Как самостоятельный метод очистки от эндотоксина ультрафильтрация обычно недостаточно надежна.

Главная сложность при удалении эндотоксинов заключается в том, что липополисахариды (ЛПС) обладают высокой стабильностью. Они могут образовывать крупные агрегаты, которые прочно связываются с целевым белком гидрофобными или ионными силами.

Методы количественного определения ЛПС: LAL-тест и альтернативы (rFC)

Содержание ЛПС в рекомбинантных белках и антителах в обязательном порядке определяют при помощи LAL-теста или более современного метода — rFC-теста.

Основные методы LAL-теста:

• Турбидиметрический метод. Измеряют скорость помутнения раствора при ферментативной реакции. Для этого анализируемый образец смешивают с LAL-реагентом, после чего фотометром или токсинометром пропускают свет через раствор и измеряют количество прошедшего или рассеянного света. Чем больше липополисахаридов (ЛПС) в образце, тем быстрее и сильнее помутнеет жидкость.
• Хромогенный метод. Этот метод основан на расщеплении синтетического пептидного субстрата с выделением желтого цвета. Сначала происходит активация фермента с помощью ЛПС. Активированный фермент отщепляет хромофор p-нитроанилин (pNA), в результате чего бесцветный раствор становится желтым. Результат замеряют на спектрофотометре: интенсивность или скорость появления оттенка прямо пропорциональна концентрации ЛПС в исследуемом образце.

— это альтернативный метод, разработанный как полноценная, гуманная и экологичная замена классическому LAL-тесту. При исследовании используют искусственно созданный фермент вместо лизата из крови мечехвоста. Это дает более точный результат, гарантирует стабильность партий реактивов и исключает животных из процесса.

При rFC-тесте рекомбинантный Фактор С распознает и связывает молекулы ЛПС, после чего происходит активация фермента. Активированный rFC расщепляет специальный синтетический субстрат, что вызывает его свечение (флуоресценцию). Флуориметр измеряет интенсивность свечения, которая прямо пропорциональна концентрации липополисахаридов (ЛПС) в образце. Чем ярче светится раствор, тем больше в нем бактериального загрязнения. В отличие от классического LAL, rFC-тест не содержит Фактора G, что полностью исключает ложноположительные реакции на (1,3)-β-D-глюканы.

Кроме того, для детекции самого ЛПС и выявления иммунного ответа на него применяется иммуноферментный анализ. Для его проведения необходимы наборы реагентов, в которых есть моноклональные антитела, подбираемые под конкретные мишени. Преимущества иммуноферментного анализа — высокая специфичность и точность, устойчивость к загрязнениям и помехам, высокая производительность и автоматизация, гуманность и независимость от биоресурсов.

Использование ЛПС в качестве положительного контроля и адъюванта

При иммуноферментном анализе и других лабораторных экспериментах ЛПС используют как «золотой стандарт» для активации клеток иммунной системы. Его связывают с TLR4 рецептором на поверхности макрофагов, дендритных клеток и моноцитов. Задача липополисахаридов (ЛПС) в данном случае — доказать, что тест-система или живой организм способны реагировать на стимуляцию.

Адъюванты — это вещества, которые усиливают иммунный ответ на антиген в водимой вакцине. В данном случае ЛПС стимулируют созревание дендритных клеток и презентацию антигена, что приводит к мощному клеточному ответу.

Источники и дополнительная литература

1. Rietschel E. T., Kirikae T., Schade F. U., Mamat U., Schmidt G., Loppnow H., Ulmer A. J., Zähringer U., Seydel U., Di Padova F. Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function // FASEB J. 8: 217-225; 1994. https://faseb.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1096/fasebj.8.2.8119492
2. Афиногенова Г.Н., Пустошилова Н.М., Смолина М.П., Рябченко А.В. Методы обнаружения бактериальных эндотоксинов в препаратах рекомбинантных белков // БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, №5 (127), 2007 г. https://cyberleninka.ru/article/n/metody-obnaruzheniya-bakterialnyh-endotoksinov-v-preparatah-rekombinantnyh-belkov/viewer
3. Гюлазян Н.М., Белая О.Ф., Малов В.А., Пак С.Г., Волчкова Е.В. Липополисахариды/эндотоксины грамотрицательных бактерий: роль в развитии интоксикации // Эпидемиология и инфекционные болезни, Том 19, №2 (2014). https://rjeid.com/1560-9529/article/view/40764/ru_RU
4. Гусаров Д.А. даунстрим-процесс очистки биофармацевтических белков // Разработка и регистрация лекарственных средств, №3 (16), 2016. https://www.google.com/url?sa=i&source=web&rct=j&url=https://www.pharmjournal.ru/jour/article/download/294/290&ved=2ahUKEwirg5if9_CWAxXBVvEDHUWFBDQQqYcPegoIAggACAAIJxAC&opi=89978449&cd&psig=AOvVaw0IAdNEj27s6aKyK2A-VogO&ust=1789573583430000