Подготовка нетривиальных образцов для ИФА
ИФА является быстрым, чувствительным, точным и надежным количественным методом анализа. Подготовка образцов для ИФА играет решающую роль в успешном эксперименте. Время отбора, обработка и хранение образцов — всё это влияет на результат анализа.
В этой статье описываются нетривиальные образцы, такие как мокрота, кожа, кал, БАЛ, слюна, спинномозговая жидкость, сперма, молоко.
1. Мокрота
Мокрота должна быть обработана перед проведением анализа. Смешать мокроту с 0,1% DTT (дитиотреитол) (двукратный объем) и шейкировать в течение 5 минут при 37° С. Добавить PBS (двукратный объем), шейкировать снова в течение еще 15-20 минут. После фильтрования через проволочную сетку (150 меш), удалить твердые частицы центрифугированием в течение 10 минут на 1500 об/мин.
2. Кал
Постарайтесь собрать не водянистый стул, так как это будет влиять на точность обнаружения. Вес более 50 мг. Трижды промойте PBS. Конечное соотношение [фекальные массы : PBS] = [1 : 9].
После измельчения ультразвуком или ручного дробления центрифугируйте при 5000g в течение 10 минут. Для анализа используйте полученный супернатант.
3. Слюна
Собрать образцы в центрифужную пробирку, а затем заморозить при -70 ° С на 1 час. Разморозить на льду и центрифировать при 2000g в течение 10 минут. Перенести осветленный супернатант в чистую пробирку для использования в анализе.
4. Семенная жидкость
Собрать сперму в стерильные контейнеры. Нормальная сперма имеет желеобразную консистенцию, поэтому требуется осуществить разжижение при помощи фибринолитических ферментов при комнатной температуре или водяной бане 37° С. Затем центрифугировать при 4000 об/мин в течение 10 минут, чтобы отделить семенную плазму для анализа.
5. Кожа
В день анализа оттаять биопсийные образцы. 20-50 мг влажной ткани гомогенизировать с помощью гомогенизатора Polytron в охлажденном PBS, содержащим коктейль ингибиторов протеаз. Гомогенаты центрифугировать в течение 20 минут при 10000g, чтобы удалить твердые частицы и нерастворимые вещества.
6. Молоко
Образец молока центрифугировать при 12000g 30 минут при температуре 4° С, после удаления липидов образцы могут быть использованы для анализа или сохранены для последующего использования.
7. Спинномозговая жидкость, БАЛ
После сбора центрифугировать образцы при 1000g в течение 20 минут для получения супернатанта.
Так как белки, как правило, легко быть денатурируют и деградируют, следовательно, процесс подготовки должен быть максимально мягким, как это возможно. Условия хранения образцов также очень важны, особенно следует избегать повторения циклов замораживания / оттаивания. Образцы можно аликвотировать. Время хранения не должно превышать одну неделю, если хранение происходит при температуре 4°С, и не должно превышать 1 месяц, если хранение происходит при -20°С, а при -80°С, не должна превышать 2 месяца. Перед процедурой анализа температура образцов должна быть доведена до комнатной температуры, использовать нагревание образцов для ускорения процесса запрещено.
Если у Вас имеются вопросы по приготовлению образцов для ИФА, пожалуйста, свяжитесь с нами:
В этой статье описываются нетривиальные образцы, такие как мокрота, кожа, кал, БАЛ, слюна, спинномозговая жидкость, сперма, молоко.
1. Мокрота
Мокрота должна быть обработана перед проведением анализа. Смешать мокроту с 0,1% DTT (дитиотреитол) (двукратный объем) и шейкировать в течение 5 минут при 37° С. Добавить PBS (двукратный объем), шейкировать снова в течение еще 15-20 минут. После фильтрования через проволочную сетку (150 меш), удалить твердые частицы центрифугированием в течение 10 минут на 1500 об/мин.
2. Кал
Постарайтесь собрать не водянистый стул, так как это будет влиять на точность обнаружения. Вес более 50 мг. Трижды промойте PBS. Конечное соотношение [фекальные массы : PBS] = [1 : 9].
После измельчения ультразвуком или ручного дробления центрифугируйте при 5000g в течение 10 минут. Для анализа используйте полученный супернатант.
3. Слюна
Собрать образцы в центрифужную пробирку, а затем заморозить при -70 ° С на 1 час. Разморозить на льду и центрифировать при 2000g в течение 10 минут. Перенести осветленный супернатант в чистую пробирку для использования в анализе.
4. Семенная жидкость
Собрать сперму в стерильные контейнеры. Нормальная сперма имеет желеобразную консистенцию, поэтому требуется осуществить разжижение при помощи фибринолитических ферментов при комнатной температуре или водяной бане 37° С. Затем центрифугировать при 4000 об/мин в течение 10 минут, чтобы отделить семенную плазму для анализа.
5. Кожа
В день анализа оттаять биопсийные образцы. 20-50 мг влажной ткани гомогенизировать с помощью гомогенизатора Polytron в охлажденном PBS, содержащим коктейль ингибиторов протеаз. Гомогенаты центрифугировать в течение 20 минут при 10000g, чтобы удалить твердые частицы и нерастворимые вещества.
6. Молоко
Образец молока центрифугировать при 12000g 30 минут при температуре 4° С, после удаления липидов образцы могут быть использованы для анализа или сохранены для последующего использования.
7. Спинномозговая жидкость, БАЛ
После сбора центрифугировать образцы при 1000g в течение 20 минут для получения супернатанта.
Так как белки, как правило, легко быть денатурируют и деградируют, следовательно, процесс подготовки должен быть максимально мягким, как это возможно. Условия хранения образцов также очень важны, особенно следует избегать повторения циклов замораживания / оттаивания. Образцы можно аликвотировать. Время хранения не должно превышать одну неделю, если хранение происходит при температуре 4°С, и не должно превышать 1 месяц, если хранение происходит при -20°С, а при -80°С, не должна превышать 2 месяца. Перед процедурой анализа температура образцов должна быть доведена до комнатной температуры, использовать нагревание образцов для ускорения процесса запрещено.
Если у Вас имеются вопросы по приготовлению образцов для ИФА, пожалуйста, свяжитесь с нами:
С нами успешно сотрудничают:
Московский государственный университет им. Ломоносова
Московский государственный университет им. Ломоносова
