Методика BIF

Методика анализа - Биослойная интерферометрия (BLI): основные этапы и реагенты

Биослойная интерферометрия (Bio-Layer Interferometry, BLI) – это мощный аналитический метод в реальном времени, используемый для анализа кинетики биомолекулярных взаимодействий (например, антитело-антиген, белок-лиганд). В отличие от методов, требующих мечения (таких как ИФА или Вестерн-блоттинг), BLI является безметочной технологией, что упрощает пробоподготовку и позволяет непосредственно измерять константы ассоциации, диссоциации) и аффинность). Метод основан на измерении интерференционного паттерна белого света, отражающегося от поверхности биосенсора, который изменяется при связывании молекул.
Рассмотрим ключевые этапы и необходимые реагенты для успешного проведения анализа.

1. Подготовка биосенсоров и реагентов

Первый этап – выбор и гидратация подходящего биосенсора. Биосенсоры различаются по химии поверхности (например, со стрептавидином или NHS-эфирными группами) для специфичного захвата одного из партнеров взаимодействия (лиганда). Аналит (вторая молекула) готовится в подходящем буфере.
Необходимые реагенты:

• Биосенсоры
• Буферы для гидратации и анализа
• Буферы для иммобилизации

2. Иммобилизация лиганда

Биосенсор погружают в базовый буфер для установления стабильного исходного уровня. Затем происходит иммобилизация лиганда на поверхность сенсора. Для антител часто используют сенсоры с Protein A, которые специфично захватывают Fc-фрагмент. Стрептавидиновые сенсоры используют для захвата биотинилированных молекул.
Необходимые реагенты:

• Лиганды для иммобилизации (очищенные антитела, белки, пептиды)
• Биотинилирующие наборы

Антитела, валидированные для BIF, в нашем каталоге здесь.

 

3. Блокирование (опционально) и регистрация базовой линии

После иммобилизации лиганда может потребоваться этап блокирования оставшихся активных групп на сенсоре для минимизации неспецифического связывания. Затем сенсор возвращают в базовый буфер для регистрации стабильной линии перед началом следующего этапа.

4. Ассоциация

Сенсор с иммобилизованным лигандом погружают в раствор с аналитом. В течение этой фазы измеряют связывание молекул аналита с лигандом на поверхности в реальном времени. Полученные данные используются для расчета константы скорости ассоциации.
Необходимые реагенты:

Аналит (очищенный белок, антитело, малая молекула)

Антитела, валидированные для BIF, в нашем каталоге здесь.

5. Диссоциация

После фазы связывания сенсор перемещают обратно в базовый буфер. В этой фазе измеряется распад комплекса «лиганд-аналит», что позволяет рассчитать константу скорости диссоциации.

6. Регенерация сенсора

Для повторного использования сенсора необходимо удалить с его поверхности как лиганд, так и аналит. Для этого применяются регенерационные буферы, которые разрушают связи, не повреждая поверхность сенсора. Правильный подбор буфера регенерации критически важен для воспроизводимости результатов.

7. Анализ данных

Специализированное программное обеспечение анализирует кривые ассоциации и диссоциации, проводит кинетическое моделирование и рассчитывает искомые константы.
Биослойная интерферометрия (BLI) предлагает быстрое и точное решение для определения аффинности и кинетики взаимодействия биомолекул. Для получения воспроизводимых результатов важно использовать высококачественные биосенсоры, буферы и реагенты.