Методика EMSA

Электрофоретический анализ подвижности ДНК-белковых комплексов (EMSA): основные этапы и реагенты

Электрофоретический анализ подвижности ДНК-белковых комплексов (EMSA) – это высокочувствительный метод изучения взаимодействий между белками и ДНК, основанный на изменении электрофоретической подвижности меченых ДНК-зондов при связывании с специфическими белками. Метод позволяет детектировать ДНК-связывающие белки, изучать их специфичность и аффинность связывания. Рассмотрим ключевые этапы и необходимые реагенты для успешного проведения анализа.

1. Подготовка ядерных экстрактов и ДНК-зондов

Первый этап включает получение ядерных экстрактов, содержащих ДНК-связывающие белки, и подготовку меченых ДНК-зондов.

Необходимые реагенты:

• Буферы для выделения ядерных белков (содержащие NP-40 или другие детергенты)

• Ингибиторы протеаз и фосфатаз

• Меченые ДНК-олигонуклеотиды (дигоксигенином или биотином)

• Наборы для мечения ДНК [Набор для биотинилирования ДНК]

2. Электрофорез в неденатурирующем геле 

Необходимые реагенты:

• Акриламид/бис-акриламид для неденатурирующих гелей

• Трис-боратный буфер (TBE) для электрофореза

• Глицерин для стабилизации белково-ДНК взаимодействий

• Неспецифические ДНК-носители (поли(dI-dC)) для снижения неспецифического связывания

3. Перенос на мембрану и детекция

После электрофореза ДНК-белковые комплексы переносят на мембрану и детектируют с помощью специфических антител.

Необходимые реагенты:

• Нейлоновые мембраны с положительным зарядом

• Антитела к метке ДНК-зонда [Анти-дигоксигениновые антитела] (см. по ссылке)

• Вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (см. по ссылке)

4. Визуализация и анализ результатов

Детекция сигнала с помощью хемилюминесценции и анализ результатов.

Необходимые реагенты:

• Хемилюминесцентные субстраты

• Системы визуализации для регистрации хемилюминесценции

• Программное обеспечение для количественного анализа

5. Контроль специфичности связывания

Проведение контрольных экспериментов для подтверждения специфичности взаимодействий.

Необходимые реагенты:

• Холодные конкуренты (немеченые специфические олигонуклеотиды)

• Мутантные олигонуклеотиды для оценки специфичности связывания

• Специфические антитела для супершифт анализа [Антитела к транскрипционным факторам]