Active Adenine Phosphoribosyltransferase (APRT) (APC310Hu01)

Аденинфосфорибозилтрансфераза (APRT) представляет собой фермент, участвующий в пути спасения пуриновых нуклеотидов и катализирующий реакцию между аденином и фосфорибозилпирофосфатом (PRPP) с образованием АМФ. Поскольку молекула адгезии сосудистого эндотелия 1 (VCAM1) была идентифицирована как партнер по взаимодействию с APRT, для детекции данного взаимодействия между рекомбинантным человеческим APRT и рекомбинантным человеческим VCAM1 был проведен иммуноферментный анализ (ИФА) связывания. Кратко: APRT серийно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащем 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА), pH 7,4. Дубликатные пробы объемом 100 мкл вносили в лунки планшета, покрытые VCAM1, и инкубировали в течение 2 ч при 37°C. После промывки лунок буфером PBST в них вносили поликлональные антитела к APRT и инкубировали 1 ч, затем раствор удаляли и проводили трехкратную промывку. Далее следовала инкубация с вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена (HRP), после чего раствор удаляли и лунки промывали три раза. После добавления субстратного раствора лунки инкубировали в течение 15–25 мин при 37°C. В завершение в лунки добавляли 50 мкл стоп-раствора и немедленно проводили измерение оптической плотности при длине волны 450 нм. Активность связывания APRT и VCAM1 представлена на рисунке 1; наблюдалась дозозависимая динамика данного эффекта.