Active Adenosylhomocysteinase (AHCY) (APG465Hu01)

Активность связывания аденозилгомоцистеиназы (AHCY) с молекулой главного комплекса гистосовместимости класса I B (MHCB) оценивали методом иммуноферментного анализа (ИФА). AHCY представляет собой фермент, катализирующий превращение S-аденозилгомоцистеина в гомоцистеин и аденозин; каждая субъединица фермента содержит прочно связанный НАД. Поскольку MHCB был идентифицирован как партнер взаимодействия AHCY, для детекции данного взаимодействия использовали рекомбинантный человеческий AHCY и рекомбинантный человеческий MHCB. Кратко: AHCY последовательно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащем 0,01% бычий сывороточный альбумин (БСА), pH 7,4. Образцы объемом 100 мкл вносили в лунки планшета, покрытые MHCB, в двух повторностях и инкубировали в течение 2 ч при 37°C. После промывки буфером PBST лунки инкубировали в течение 1 ч с поликлональными антителами к AHCY, затем раствор удаляли и проводили трехкратную промывку. Далее вносили вторичные антитела, меченные пероксидазой хрена (HRP), после чего снова удаляли раствор и трехкратно промывали лунки. Добавляли субстратный раствор и инкубировали 15–25 мин при 37°C. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл стоп-раствора в каждую лунку и немедленно измеряли оптическую плотность при 450 нм. Результаты, представленные на Рисунке 1, демонстрируют дозозависимый характер связывания AHCY с MHCB.