Active Angiotensin I Converting Enzyme 2 (ACE2) (APB886Hu61)

Активность рекомбинантного человеческого ACE2 (rhACE2) оценивали по способности расщеплять флуорогенный пептидный субстрат MCA-Tyr-Val-Ala-Asp-Ala-Pro-Lys(DNP)-OH в буфере для анализа (50 мМ Tris, 1 М NaCl, pH 7,5). rhACE2 разводили в буфере для анализа до концентрации 0,5 мкг/мл. В лунки черного планшета вносили по 50 мкл раствора rhACE2 (0,5 мкг/мл) и инициировали реакцию добавлением 50 мкл 20 мкМ субстрата; в качестве холостого опыта использовали смесь, содержащую 50 мкл буфера для анализа и 50 мкл субстрата без добавления rhACE2. Регистрацию сигнала проводили в кинетическом режиме в течение 5 минут при длинах волн возбуждения 320 нм и эмиссии 405 нм. Удельная активность рекомбинантного человеческого ACE2 составила >1100 пмоль/мин/мкг.

Ангиотензинпревращающий фермент 2 (ACE2), являясь трансмембранным белком, служит основным рецептором для проникновения в клетки некоторых коронавирусов, включая HCoV-NL63, SARS-CoV и SARS-CoV-2. В частности, связывание S1-субъединицы белка шипа SARS-CoV и SARS-CoV-2 с каталитическим доменом ACE2 на поверхности клетки приводит к эндоцитозу и транслокации как вируса, так и фермента внутриклеточные эндосомы. Кроме того, недавние исследования показывают, что белки шипа (S) вирусов 2019-nCoV и SARS-CoV могут использовать один и тот же клеточный рецептор - ангиотензинпревращающий фермент 2 (ACE2) - для проникновения в клетки-хозяева; в связи с этим был проведен связывающий иммуноферментный анализ (ИФА) для детекции взаимодействия рекомбинантного человеческого ACE2 и рекомбинантного гликопротеина RBD белка шипа. Кратко: биотинилированный ACE2 серийно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА, pH 7,4). Дубликатные пробы объемом 100 мкл переносили в лунки микропланшета, покрытые RBD, и инкубировали в течение 2 ч при 37 °C. Лунки трижды промывали PBS с Tween 20 (PBST), после чего проводили инкубацию с конъюгатом пероксидазы хрена (HRP) в течение 30 мин; затем раствор удаляли, а лунки промывали пять раз. После добавления субстратного раствора лунки инкубировали 15–25 мин при 37 °C. В завершение в лунки добавляли по 50 мкл стоп-раствора и немедленно проводили измерение оптической плотности при 450 нм. Активность связывания ACE2 и RBD представлена на рисунке 1 и демонстрирует дозозависимый характер.