Active Aprotinin (AP) (APA968Bo61)

Апротинин (AP) представляет собой конкурентный ингибитор сериновых протеаз, который обратимо связывается с активным центром фермента и блокирует его, подавляя активность трипсина, химотрипсина, калликреина и плазмина, а также цитопатогенное действие SARS-CoV-2 и образование двуцепочечной РНК в инфицированных клетках. Активность рекомбинантного бычьего AP оценивали по способности ингибировать расщепление трипсином пептидного субстрата BAPNA в буферном растворе (200 мМ солянокислый триэтаноламин, 20 мМ CaCl2, pH 7,8). Реакцию инициировали добавлением 100 мкл 1 мг/мл BAPNA к смеси, содержащей 20 мкл 4 мг/мл трипсина (разведенного в 1 мМ HCl), 160 мкл буфера и 20 мкл 0,85% (мас./об.) NaCl. Контроль субстрата включал 160 мкл буфера, 20 мкл 1 мМ HCl, 20 мкл 0,85% NaCl и 100 мкл субстрата. После быстрого перемешивания при 25 °C кинетику реакции регистрировали в течение 5 минут при 405 нм на микропланшетном ридере (контроль скорости изменения оптической плотности A405 нм/мин = 0,08–0,12). Для анализа 20 мкл рекомбинантного бычьего AP в различных концентрациях инкубировали с 20 мкл 4 мг/мл трипсина в 160 мкл буфера при 25 °C в течение 10 минут, после чего добавляли 100 мкл субстрата и проводили измерение при 405 нм в кинетическом режиме в течение 5 минут. В данных условиях единицей активности считается количество фермента, обеспечивающее 50%-ное ингибирование активности трипсина в минуту. Удельная активность рекомбинантного бычьего AP составляет >2000 Ед/мг.