Active Arginase (ARG) (APB120Hu01)

Аргиназа (Arg) - это фермент, катализирующий распад аргинина с образованием мочевины и орнитина, что играет ключевую роль в цикле мочевины. У большинства млекопитающих существуют две изоформы этого фермента: аргиназа I, функционирующая в цикле мочевины и локализованная преимущественно в цитоплазме печени, и аргиназа II, участвующая в регуляции внутриклеточных концентраций аргинина и орнитина. Кроме того, убиквитин-карбоксил-терминальная гидролаза L5 (UCHL5) была идентифицирована как белок-партнер аргиназы. Для детекции взаимодействия рекомбинантного человеческого Arg и рекомбинантного человеческого UCHL5 был проведен связывающий иммуноферментный анализ (ИФА). Кратко: раствор Arg серийно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА), pH 7,4. Дубликатные пробы объемом 100 мкл вносили в лунки планшета, покрытые UCHL5, и инкубировали в течение 2 ч при 37 °C. После промывки лунок буфером PBST добавляли поликлональные антитела к Arg и инкубировали 1 ч, затем раствор удаляли и проводили трехкратную промывку. Далее вносили вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP), после чего снова удаляли раствор и трехкратно промывали лунки. Добавляли субстратный раствор и инкубировали 15–25 мин при 37 °C. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл стоп-раствора в каждую лунку и немедленно измеряли оптическую плотность при длине волны 450 нм. Активность связывания между Arg и UCHL5 представлена на рисунке 1; наблюдалась дозозависимая динамика данного эффекта.