Active Aspartate Aminotransferase (AST) (APB214Mu01)

Аспартатаминотрансфераза (АСТ), также известная как глутамат-оксалоацетаттрансаминаза, представляет собой пиридоксальфосфат-зависимый фермент, катализирующий обратимый перенос α-аминогруппы между аспартатом и глутаматом, что делает его ключевым ферментом метаболизма аминокислот. В данном тесте аминогруппа переносится от аспартата к α-кетоглутарату; продуктами этой обратимой реакции трансаминирования являются оксалоацетат и глутамат. Оксалоуксусная кислота в присутствии фениламинцитрата разлагается на пируват и диоксид углерода. Активность АСТ определяют путем расчета концентрации образовавшегося пирувата. Реакцию проводили, добавляя 10 мкл рекомбинантной АСТ в различных концентрациях (в контрольную пробу добавляли 10 мкл фосфатного буфера) к 50 мкл субстратной смеси, содержащей 2 мМ α-кетоглутаровую кислоту и 0,1 М L-аспарагиновую кислоту в 0,2 М фосфатном буфере (pH 7,4), и инкубировали при 37 °C в течение 1 ч. Затем добавляли 10 мкл фениламинцитрата и 50 мкл 2,4-динитрофенилгидразина и продолжали инкубацию при 37 °C в течение 20 мин. Реакцию останавливали добавлением 500 мкл 0,4 М NaOH и измеряли оптическую плотность при 520 нм. Калибровочную кривую строили путем двукратных разведений 2 мМ раствора пирувата в фосфатном буфере с последующим добавлением 10 мкл фениламинцитрата и 50 мкл 2,4-динитрофенилгидразина, инкубацией при 37 °C в течение 20 мин и регистрацией оптической плотности при 520 нм. Одна единица активности АСТ соответствует количеству фермента, образующего 1 мкмоль пирувата в минуту при pH 7,4 и температуре 37 °C.