Active Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP2) (APA013Hu01)

Белок морфогенеза кости 2 (BMP2), относящийся к суперсемейству трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), играет ключевую роль в развитии костной и хрящевой тканей, участвует в сигнальных путях Hedgehog и TGF-β, а также во взаимодействиях цитокин–рецептор цитокина. BMP2 вовлечен в дифференцировку кардиомиоцитов и эпителиально-мезенхимальный переход. Подобно другим белкам семейства BMP, BMP2 способен мощно индуцировать дифференцировку остеобластов в различных типах клеток. Поскольку ноггин (NOG) идентифицирован как партнер по взаимодействию с BMP2, для детекции связывания рекомбинантного человеческого BMP2 и рекомбинантного человеческого NOG был проведен связывающий иммуноферментный анализ (ИФА). Кратко: BMP2 серийно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА), pH 7,4. Дубликатные пробы объемом 100 мкл вносили в лунки планшета, покрытые NOG, и инкубировали в течение 2 ч при 37 °C. После промывки буфером PBST лунки инкубировали в течение 1 ч с поликлональными антителами к BMP2, затем содержимое удаляли и проводили трехкратную промывку. Далее следовала инкубация с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP), после чего снова выполняли удаление содержимого и трехкратную промывку. После внесения субстратного раствора лунки инкубировали 15–25 мин при 37 °C. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл стоп-раствора в каждую лунку и немедленно измеряли оптическую плотность при длине волны 450 нм. Активность связывания BMP2 и NOG представлена на рисунке 1; наблюдалась дозозависимая динамика эффекта.

Для оценки влияния BMP2 на апоптоз клеток HepG2 клетки высевали в трех повторностях в 96-луночные планшеты по 4000 клеток/лунку и инкубировали в течение ночи для адгезии, после чего среду заменяли на стандартную DMEM с 5% сывороткой, содержащую рекомбинантный человеческий BMP2 в различных концентрациях. После 72-часовой инкубации клетки исследовали с помощью инвертированного микроскопа, а пролиферацию клеток оценивали с использованием набора CCK-8 (Cell Counting Kit-8). Кратко: в каждую лунку добавляли 10 мкл раствора CCK-8, затем после инкубации планшета в течение 1–4 часов при 37 °C измеряли оптическую плотность при 450 нм на микропланшетном ридере. Результаты наблюдения апоптоза клеток HepG2 после 72-часовой инкубации с BMP2 представлены на рисунке 1. Жизнеспособность клеток оценивали методом CCK-8 после 72-часовой инкубации с рекомбинантным человеческим BMP2; результаты показаны на рисунке 2. Было установлено, что BMP2 достоверно снижает жизнеспособность клеток HepG2. Значение ED50 для рекомбинантного человеческого BMP2 составило 3,25 мкг/мл.