Active Bone Morphogenetic Protein 4 (BMP4) (APA014Hu02)

Белок BMP4 (костный морфогенетический белок 4), являющийся членом семейства костных морфогенетических белков и участвующий в развитии костной и хрящевой тканей (в частности, формировании зубов и конечностей, а также репарации переломов), был исследован на способность связываться с гемоювелином (HJV), который выступает в роли корецептора для BMP, включая BMP4. Для оценки взаимодействия рекомбинантного человеческого BMP4 с рекомбинантным человеческим HJV был проведен иммуноферментный анализ (ИФА) связывания. Кратко: BMP4 серийно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА, pH 7,4). По 100 мкл каждого разведения в двух повторностях вносили в лунки планшета, покрытые HJV, и инкубировали в течение 2 ч при 37°C. После промывки лунок буфером PBST добавляли поликлональные антитела к BMP4 и инкубировали 1 ч, затем раствор удаляли и проводили трехкратную промывку. Далее вносили вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP), после чего снова удаляли раствор и трехкратно промывали лунки. Для детекции добавляли субстратный раствор и инкубировали 15–25 мин при 37°C. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл стоп-раствора в каждую лунку и немедленно измеряли оптическую плотность при длине волны 450 нм. Результаты, представленные на рисунке 1, демонстрируют дозозависимый характер связывания BMP4 с HJV.

Для оценки влияния BMP4 на апоптоз клеток HepG2 клетки высевали в трех повторностях в 96-луночные планшеты по 4000 клеток/лунку и инкубировали в течение ночи для адгезии, после чего среду заменяли на стандартную DMEM с 5% сыворотки, содержащую рекомбинантный человеческий BMP4 в различных концентрациях. После 72-часовой инкубации клетки исследовали с помощью инвертированного микроскопа, а пролиферацию клеток оценивали с использованием набора CCK-8 (Cell Counting Kit-8). Кратко: в каждую лунку планшета добавляли 10 мкл раствора CCK-8, затем после инкубации планшета в течение 1–4 часов при 37 °C измеряли оптическую плотность при 450 нм на микропланшетном ридере. На рис. 1 представлены результаты наблюдения за апоптозом клеток HepG2 после 72-часовой инкубации с BMP4 с помощью инвертированного микроскопа. На рис. 2 показаны результаты оценки жизнеспособности клеток методом CCK-8 после 72-часовой инкубации с рекомбинантным человеческим BMP4. Было установлено, что BMP4 достоверно снижает жизнеспособность клеток HepG2. Значение ED50 для рекомбинантного человеческого BMP4 составило 5,1 мкг/мл.

На рисунке 2 показано ингибирование пролиферации клеток HepG2 после стимуляции рекомбинантным человеческим белком BMP4.