Active Calpain 1 (CAPN1) (APB964Ra02)

Кальпаин-1 (большая субъединица, CAPN1) представляет собой внутриклеточную протеазу, требующую кальций для каталитической активности. Это кальций-регулируемая нелизосомальная тиол-протеаза, осуществляющая ограниченный протеолиз субстратов, вовлеченных в ремоделирование цитоскелета и передачу сигналов; обладает широкой эндопептидазной специфичностью. Поскольку было установлено, что STAT3 (сигнальный трансдуктор и активатор транскрипции 3) взаимодействует с CAPN1, для детекции данного взаимодействия был проведен связывающий иммуноферментный анализ (ИФА) с использованием рекомбинантных белков крысы CAPN1 и STAT3. Кратко: CAPN1 серийно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 0,01% БСА (pH 7,4). Дубликатные пробы объемом 100 мкл вносили в лунки планшета, покрытые STAT3, и инкубировали в течение 2 ч при 37 °C. После промывки буфером PBST лунки инкубировали в течение 1 ч с поликлональными антителами к CAPN1, затем содержимое удаляли и проводили трехкратную промывку. Далее добавляли вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP), после чего снова удаляли раствор и трехкратно промывали лунки. После внесения субстратного раствора лунки инкубировали 15–25 мин при 37 °C. В завершение в лунки добавляли по 50 мкл стоп-раствора и немедленно измеряли оптическую плотность при 450 нм. Активность связывания CAPN1 и STAT3 представлена на рисунке 1; наблюдалась дозозависимая динамика данного эффекта.