Active Caspase 3 (CASP3) (APA626Hu01)

Каспаза-3 относится к семейству цистеиновых протеаз, расщепляющих белки по остаткам аспарагиновой кислоты. Последовательная активация каспаз играет ключевую роль в фазе исполнения апоптоза. Каспазы существуют в виде неактивных проферментов, которые подвергаются протеолитическому процессингу по консервативным остаткам аспарагиновой кислоты с образованием большой и малой субъединиц, димеризующихся в активный фермент. Данный белок расщепляет и активирует каспазы 6 и 7, а сам активируется каспазами 8, 9 и 10. Каспаза-3 гидролизует пептидный субстрат ацетил-Асп-Глу-Вал-Асп-п-нитроанилид (Ac-DEVD-pNA), что приводит к высвобождению п-нитроанилина (pNA), обладающего высоким поглощением при длине волны 405 нм. Активность рекомбинантной человеческой каспазы-3 определяли путем расчета концентрации высвобожденного pNA. Реакцию проводили, добавляя в лунки 96-луночного планшета 50 мкл 2× буфера (50 мМ HEPES, 100 мМ NaCl, 10 мМ DTT, 2 мМ ЭДТА, 10% глицерин), затем вносили по 50 мкл каспазы-3 в различных концентрациях (разведенной 1× буфером: 25 мМ HEPES, 50 мМ NaCl, 5 мМ DTT, 1 мМ ЭДТА, 5% глицерин) и, наконец, добавляли по 5 мкл 4 ммоль Ac-DEVD-pNA в каждую лунку. Планшеты инкубировали при 37°C в течение 2 ч. Калибровочную кривую pNA строили путем двукратных разведений 200 мкМ pNA в 1× буфере и регистрировали оптическую плотность при 405 нм. Активность каспазы-3 рассчитывали как количество пмоль высвобожденного pNA в минуту на 1 мкг рекомбинантной человеческой каспазы-3. Удельная активность рекомбинантной человеческой каспазы-3 составила 2196 пмоль/мин/мкг.