Active Caspase 3 (CASP3) (APA626Ra03)

Каспаза-3 относится к семейству цистеиновых протеаз, расщепляющих белки по остаткам аспарагиновой кислоты (каспазы). Последовательная активация каспаз играет центральную роль в исполнительной фазе апоптоза. Каспазы существуют в виде неактивных проферментов, которые подвергаются протеолитическому процессингу по консервативным остаткам аспарагиновой кислоты с образованием двух субъединиц (большой и малой), димеризующихся с формированием активного фермента. Данный белок расщепляет и активирует каспазы 6 и 7; сам он процессируется и активируется каспазами 8, 9 и 10. Каспаза-3 гидролизует пептидный субстрат ацетил-Асп-Глу-Вал-Асп-п-нитроанилид (Ac-DEVD-pNA), что приводит к высвобождению фрагмента п-нитроанилина (pNA). П-нитроанилин обладает высоким поглощением при длине волны 405 нм. Таким образом, активность рекомбинантной каспазы-3 крысы можно измерить, рассчитав концентрацию высвобожденного pNA. Реакцию проводили следующим образом: в 96-луночный планшет вносили 50 мкл 2× буфера (50 мМ HEPES, 100 мМ NaCl, 10 мМ DTT, 2 мМ ЭДТА, 10% глицерин), затем добавляли по 50 мкл каспазы-3 в различных концентрациях (разведенной 1× буфером: 25 мМ HEPES, 50 мМ NaCl, 5 мМ DTT, 1 мМ ЭДТА, 5% глицерин) в каждую лунку, после чего добавляли по 5 мкл 4 мМ Ac-DEVD-pNA в каждую лунку. Планшеты закрывали и инкубировали при 37 °C в течение 1 ч. Стандартную кривую п-нитроанилина (pNA) готовили путем двукратных разведений 200 мкМ pNA в 1× буфере и регистрировали значение оптической плотности при 405 нм. Удельная активность рекомбинантной каспазы-3 крысы составляет >3300 пмоль/мин/мкг.