Active Cathepsin D (CTSD) (APB280Hu61)

Катепсин D (CSTD) представляет собой аспарагиновую протеазу, активность которой критически зависит от протонирования остатка аспарагиновой кислоты в активном центре. Наряду с протонированием аспарагиновой кислоты, снижение pH вызывает конформационную перестройку катепсина D: N-концевой сегмент протеазы выходит из активного центра при снижении pH. Как и другие аспарагиновые протеиназы, катепсин D способен связывать до 8 аминокислотных остатков в связывающей щели активного центра. К основным физиологическим функциям катепсина D относятся метаболическая деградация внутриклеточных белков, активация и деградация полипептидных гормонов и факторов роста, активация ферментативных предшественников, процессинг активаторов и ингибиторов ферментов, процессинг мозговых антигенов и регуляция программируемой клеточной гибели. Кроме того, было установлено, что белок теплового шока 90 кДа бета 1 (HSP90b1) взаимодействует с CSTD; в связи с этим был проведен иммуноферментный анализ (ИФА) связывания для детекции взаимодействия рекомбинантного человеческого CSTD и рекомбинантного человеческого HSP90b1. Вкратце, CSTD серийно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА), pH 7,4. Дубликатные пробы объемом 100 мкл вносили в лунки микротитровального планшета, покрытые HSP90b1, и инкубировали в течение 2 ч при 37 °C. Лунки промывали буфером PBST и инкубировали в течение 1 ч с поликлональными антителами к CSTD, после чего раствор удаляли и проводили трехкратную промывку. После инкубации с вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена (HRP), раствор удаляли и лунки трижды промывали. После добавления субстратного раствора лунки инкубировали в течение 15–25 мин при 37 °C. В завершение в лунки добавляли по 50 мкл стоп-раствора и немедленно проводили измерение оптической плотности при 450 нм. Активность связывания CSTD и HSP90b1 представлена на рисунке 1; данный эффект носил дозозависимый характер.