Active Cluster Of Differentiation 73 (CD73) (APB250Hu01)

5'-Нуклеотидаза экто (NT5E), также известная как экто-5'-нуклеотидаза или CD73, представляет собой фермент, катализирующий гидролиз нуклеозид-5'-монофосфатов до нуклеозидов и неорганического фосфата. Фермент является димером, состоящим из двух идентичных субъединиц массой 70 кДа, связанных с внешней поверхностью плазматической мембраны посредством гликозилфосфатидилинозитолового якоря. NT5E служит маркером дифференцировки лимфоцитов и выполняет функции, не зависящие от его каталитической активности, такие как активация Т-клеток и межклеточная адгезия. Другие формы 5'-нуклеотидазы присутствуют в цитоплазме и лизосомах; их можно отличить от NT5E по сродству к субстрату, потребности в двухвалентных ионах магния, активации АТФ и ингибированию неорганическим фосфатом. Фермент широко распространен в тканях человека и животных. Кроме того, было установлено, что член 1 семейства AF4/FMR2 (AFF1) взаимодействует с NT5E. В связи с этим был проведен иммуноферментный анализ (ИФА) связывания для детекции взаимодействия рекомбинантного человеческого NT5E и рекомбинантного человеческого AFF1. Кратко: NT5E последовательно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА, pH 7,4). Дубликатные пробы объемом 100 мкл вносили в лунки планшета, покрытые AFF1, и инкубировали в течение 2 ч при 37 °C. Лунки промывали буфером PBST и инкубировали в течение 1 ч с поликлональными антителами к NT5E, после чего содержимое удаляли и проводили трехкратную промывку. Затем добавляли вторичное антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP), удаляли раствор и снова промывали лунки три раза. После внесения субстратного раствора лунки инкубировали в течение 15–25 мин при 37 °C. Наконец, в лунки добавляли 50 мкл стоп-раствора и немедленно измеряли оптическую плотность при длине волны 450 нм. Активность связывания NT5E и AFF1 представлена на рисунке 1; данный эффект носил дозозависимый характер.