Active Connective Tissue Growth Factor (CTGF) (APA010Ra01)

Белок фактора роста соединительной ткани (CTGF, также известный как CCN2) представляет собой матриксный белок семейства CCN, связывающий гепарин и ассоциированный с внеклеточным матриксом. CTGF играет важную роль во многих биологических процессах, включая адгезию, миграцию и пролиферацию клеток, ангиогенез, развитие скелета и репарацию тканей, а также критически вовлечен в развитие фиброзных заболеваний и различных форм рака. Поскольку бета-актин (ACTb) был идентифицирован как партнер взаимодействия CTGF, для детекции связи между рекомбинантным крысиным CTGF и рекомбинантным крысиным ACTb был проведен иммуноферментный анализ связывания (ELISA). Кратко: CTGF серийно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 0,01% БСА (pH 7,4). Дубликаты проб объемом 100 мкл вносили в лунки планшета, покрытые ACTb, и инкубировали в течение 2 ч при 37 °C. После промывки буфером PBST лунки инкубировали в течение 1 ч с поликлональными антителами к CTGF, затем раствор удаляли и проводили трехкратную промывку. После инкубации с вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена (HRP), раствор удаляли и лунки промывали три раза. Затем добавляли субстратный раствор и инкубировали лунки в течение 15–25 мин при 37 °C. В завершение в лунки добавляли по 50 мкл стоп-раствора и немедленно проводили измерение оптической плотности при длине волны 450 нм. Результаты, представленные на рисунке 1, демонстрируют связывание CTGF с ACTb, которое носит дозозависимый характер.

Для оценки влияния CTGF на адгезию клеток проводили следующий эксперимент: 100 мкл раствора рекомбинантного белка CTGF в PBS инкубировали в течение ночи при 4 °C в 96-луночных планшетах для ИФА. Лунки блокировали добавлением 200 мкл PBS, содержащего 3% БСА, после чего вносили 100 мкл суспензии клеток 3T3 (примерно 5×10⁴ клеток) в PBS и инкубировали в течение 1 ч при 37 °C. Адгезированные клетки фиксировали 5% формальдегидом в течение 15 мин, неадгезированные клетки удаляли трехкратным промыванием лунки PBS. Оставшиеся клетки окрашивали 0,5% раствором кристаллвиолета в течение 10 мин и проводили подсчет клеток при большом увеличении (×400) в пяти случайно выбранных полях зрения для каждой лунки. Результаты: (A) клетки 3T3, высаженные в лунки с CTGF (1 мкг/мл) и инкубированные в течение 1 ч при 37 °C; (B) клетки 3T3, высаженные в лунки без CTGF и инкубированные в течение 1 ч при 37 °C.