Ингибирование папаина рекомбинантным цистатином D человека
Цистатин D относится к семейству 2 суперсемейства цистатинов; в отличие от других представителей этого семейства, он характеризуется ограниченным тканевым распределением и обнаруживается только в слюне и слезной жидкости. Известны два аллельных варианта человеческого белка (Arg46 и Cys46), которые не имеют существенных различий в ингибирующей активности в отношении папаина и катепсинов B, H, L и S. Рекомбинантный цистатин D человека соответствует варианту Arg46. Функции цистатина D в значительной степени неизвестны, однако показано, что он ингибирует репликацию коронавируса при физиологических концентрациях (0,12–1,9 мкМ) и, предположительно, играет защитную роль против протеаз полости рта. Активность рекомбинантного цистатина D человека оценивали по его способности ингибировать расщепление папаином флуорогенного пептидного субстрата Z-FR-AMC в assay-буфере (50 мМ Tris, pH 7,0). Папаин разводили до концентрации 500 мкг/мл в буфере для активации (50 мМ Tris, 5 мМ DTT, pH 7,0) и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут. Активированный папаин разводили до 100 мкг/мл в assay-буфере, после чего 20 мкл рекомбинантного цистатина D человека (молекулярная масса 17,45 кДа) в различных концентрациях инкубировали с 20 мкл папаина (100 мкг/мл) при 37 °C в течение 10 минут. По 50 мкл инкубированных смесей, разведенных в пять раз в assay-буфере, вносили в лунки планшета и инициировали реакцию добавлением 50 мкл субстрата (200 мкМ). В качестве контроля включали холостую пробу с субстратом, содержащую 50 мкл assay-буфера и 50 мкл субстрата (200 мкМ). Регистрацию сигнала проводили в кинетическом режиме в течение 5 минут при длинах волн возбуждения и эмиссии 380 нм и 460 нм соответственно. Как показано на рисунке 1, рекомбинантный цистатин D человека достоверно снижал активность папаина; значение IC50 ингибирования составило <200 нМ.
