Active Cytochrome P450 3A4 (CYP3A4) (APD299Hu01)

Цитохром P450 3A4 (CYP3A4) - важный фермент, преимущественно экспрессируемый в печени и кишечнике, который окисляет ксенобиотики (например, токсины или лекарственные препараты), обеспечивая их выведение из организма. CYP3A4 относится к семейству окисляющих ферментов цитохрома P450 и является наиболее распространенным и универсальным ферментом в метаболизме лекарственных средств. Белок теплового шока 70 кДа 8 (HSPA8) идентифицирован как партнер по взаимодействию для CYP3A4. Для детекции взаимодействия рекомбинантного человеческого CYP3A4 и рекомбинантного человеческого HSPA8 был проведен иммуноферментный анализ (ИФА) связывания. Кратко: CYP3A4 серийно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА, pH 7,4). Дубликатные пробы объемом 100 мкл вносили в лунки планшета, покрытые HSPA8, и инкубировали в течение 2 ч при 37 °C. После промывки буфером PBST лунки инкубировали в течение 1 ч с поликлональными антителами к CYP3A4, затем раствор удаляли и проводили трехкратную промывку. Далее проводили инкубацию с вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена (HRP), после чего раствор удаляли и лунки промывали три раза. После добавления субстратного раствора лунки инкубировали в течение 15–25 мин при 37 °C. В завершение в лунки добавляли по 50 мкл стоп-раствора и немедленно измеряли оптическую плотность при 450 нм. Результаты, представленные на рис. 1, демонстрируют связывание CYP3A4 с HSPA8, которое носит дозозависимый характер.