Active Defensin Beta 2 (DEFb2) (APA072Hu01)

Дефензин бета-2 (DEFb2) представляет собой секретируемый белок массой 7 кДа, обладающий антимикробной активностью в отношении грамотрицательных и грамположительных бактерий, причем наибольшая активность наблюдается против грамотрицательных бактерий. Антимикробная активность против *P. aeruginosa* зависит от концентрации солей и снижается при их содержании выше 25 мМ. кДНК человеческого DEFb2 кодирует белок из 64 аминокислот, включающий сигнальный пептид из 23 аминокислот и зрелую последовательность из 41 аминокислоты. Поскольку было установлено, что Toll-подобный рецептор 4 (TLR4) взаимодействует с DEFb2, для детекции данного взаимодействия между рекомбинантным человеческим DEFb2 и рекомбинантным человеческим TLR4 был проведен иммуноферментный анализ (ИФА) связывания. Кратко: DEFb2 серийно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 0,01% БСА (pH 7,4). Дубликатные пробы объемом 100 мкл вносили в лунки планшета, покрытые TLR4, и инкубировали в течение 1 ч при 37 °C. Лунки промывали буфером PBST и инкубировали в течение 1 ч с поликлональными антителами к DEFb2, после чего содержимое удаляли и проводили трехкратную промывку. Затем лунки инкубировали с вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена (HRP), в течение 1 ч при 37 °C, после чего содержимое удаляли и проводили пятикратную промывку. После внесения субстратного раствора лунки инкубировали в течение 15–25 мин при 37 °C. В завершение в лунки добавляли 50 мкл стоп-раствора и немедленно проводили измерение оптической плотности при длинах волн 450/630 нм. Активность связывания DEFb2 и TLR4 представлена на рисунке 1; значение EC50 для данного эффекта составило 0,11 мкг/мл.