Active Deoxyribonuclease I (DNASE1) (APB127Hu01)

Дезоксирибонуклеаза I (DNase I) представляет собой неспецифическую эндонуклеазу, расщепляющую ДНК преимущественно по фосфодиэфирным связям, соседним с пиримидиновым нуклеотидом, с образованием полинуклеотидов, терминальных по 5'-фосфату и имеющих свободную гидроксильную группу в положении 3'; средний размер продуктов расщепления составляет тетрануклеотиды. Фермент активен в отношении одноцепочечной и двуцепочечной ДНК, а также хроматина. Активация DNase I осуществляется двухвалентными металлами, такими как Mg²⁺ и Ca²⁺. Данная эндонуклеаза широко применяется в биохимических методах, требующих деградации ДНК для выделения РНК, либо для удаления ДНК без воздействия на структурные белки или ферменты. В частности, DNase I используют для элиминации матричной ДНК после транскрипции in vitro и удаления контаминирующей ДНК из препаратов тотальной РНК (особенно из трансфицированных клеток, которые могут содержать плазмидную ДНК). Фермент также применяется в анализах защиты от рибонуклеазы, конструировании кДНК-библиотек и ОТ-ПЦР. Поскольку бета-актин (ACTb) идентифицирован как белок-партнер DNase I, для детекции взаимодействия рекомбинантного человеческого DNase I и рекомбинантного человеческого ACTb был проведен иммуноферментный анализ связывания (ELISA). Кратко: DNase I серийно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 0,01% БСА (pH 7,4). Дубликатные пробы объемом 100 мкл вносили в лунки планшета, покрытые ACTb, и инкубировали в течение 2 ч при 37 °C. После промывки буфером PBST лунки инкубировали в течение 1 ч с поликлональными антителами к DNase I, затем содержимое удаляли и проводили трехкратную промывку. Далее следовала инкубация с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP), после чего лунки снова опорожняли и трехкратно промывали. После внесения субстратного раствора лунки инкубировали в течение 15–25 мин при 37 °C. В завершение в лунки добавляли 50 мкл стоп-раствора и немедленно проводили измерение оптической плотности при 450 нм. Активность связывания DNase I и ACTb представлена на рисунке 1; наблюдалась дозозависимая динамика данного эффекта.