Active Endonuclease G, Mitochondrial (ENDOG) (APC457Ra01)

Эндонуклеаза G (ENDOG) представляет собой митохондриальный фермент, расщепляющий ДНК в участках с двухцепочечными последовательностями (DG)n и (DC)n, а также в одноцепочечных трактах (DC)n. Данный белок также обладает рибонуклеазной (РНКаза) активностью и активностью РНКазы H. Сообщается, что EndoG образует комплексы с рядом других белков, включая белок теплового шока 70 кДа (HSP70). При этом аминокислотная последовательность мышиного белка HSPA1A (белок теплового шока 70 кДа 1A) имеет 98,44% идентичности с крысиным белком HSP1A1. В связи с этим был проведен связывающий иммуноферментный анализ (ИФА) для детекции взаимодействия рекомбинантного крысиного белка ENDOG с рекомбинантным мышиным белком HSPA1A. Кратко: раствор ENDOG серийно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащем 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА), pH 7,4. Дубликатные пробы объемом 100 мкл вносили в лунки планшета, покрытые белком HSP1A1, и инкубировали в течение 2 ч при 37°C. После промывки лунок буфером PBST в них вносили поликлональные антитела к ENDOG и инкубировали 1 ч, затем содержимое удаляли и проводили трехкратную промывку. Далее добавляли вторичное антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP), после чего снова удаляли содержимое и трехкратно промывали лунки. После внесения субстратного раствора лунки инкубировали в течение 15–25 мин при 37°C. В завершение в лунки добавляли по 50 мкл стоп-раствора и немедленно измеряли оптическую плотность при длине волны 450 нм. Активность связывания ENDOG с HSP1A1 представлена на рисунке 1; данный эффект носил дозозависимый характер.