Active Fibronectin (FN) (APA037Hu01)

Фибронектин (FN) представляет собой высокомолекулярный (~440 кДа) гликопротеин внеклеточного матрикса, связывающийся с трансмембранными рецепторными белками - интегринами. Фибронектины взаимодействуют с поверхностью клеток и различными соединениями, включая коллаген, фибрин, гепарин, ДНК и актин. FN выполняет множество функций, таких как обеспечение клеточной адгезии, подвижности клеток, опсонизация, заживление ран и поддержание формы клетки. Поскольку декорин (DCN) идентифицирован как партнер взаимодействия FN, для детекции связи между рекомбинантным человеческим FN и рекомбинантным человеческим DCN был проведен связывающий иммуноферментный анализ (ИФА). Кратко: FN серийно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА), pH 7,4. Дубликатные пробы объемом 100 мкл вносили в лунки планшета, покрытые DCN, и инкубировали в течение 2 ч при 37 °C. После промывки буфером PBST лунки инкубировали в течение 1 ч с поликлональными антителами против FN, затем содержимое удаляли и проводили трехкратную промывку. После инкубации с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP), лунки снова промывали трехкратно. Добавляли субстратный раствор и инкубировали лунки в течение 15–25 мин при 37 °C. В завершение в лунки вносили по 50 мкл стоп-раствора и немедленно измеряли оптическую плотность при 450 нм. Активность связывания FN и DCN представлена на рисунке 1; наблюдалась дозозависимая динамика этого эффекта.

Поскольку фибронектин (FN) обладает функцией клеточной адгезии, его активность оценивали по способности иммобилизованного белка поддерживать адгезию эмбриональных фибробластов мыши линии NIH-3T3. При внесении 5×10⁴ клеток в лунку на планшеты, покрытые рекомбинантным человеческим фибронектином (10 мкг/мл, объем 100 мкл/лунку), после 3-часовой инкубации при 37 °C адгезировало приблизительно 70–80 % клеток. Адгезия клеток NIH-3T3 после 3-часовой инкубации при 37 °C, наблюдаемая с помощью инвертированного микроскопа, представлена на рисунке 2.