Active Galectin 3 (GAL3) (APA303Hu01)

Галектин-3 (GAL3), относящийся к семейству лектинов и белков, связывающих бета-галактозиды, играет важную роль в межклеточной адгезии, взаимодействии клеток с матриксом, активации макрофагов, ангиогенезе, метастазировании и апоптозе. Данный белок также вовлечен в патогенез рака, воспаления, фиброза, сердечно-сосудистых заболеваний и инсульта. GAL3 экспрессируется в ядре, цитоплазме, митохондриях, на клеточной поверхности и во внеклеточном пространстве. Поскольку альфа-2-гликопротеин Геремана-Шмида (aHSG) идентифицирован как партнер взаимодействия GAL3, для детекции связи между рекомбинантным человеческим GAL3 и рекомбинантным человеческим aHSG был проведен иммуноферментный анализ (ИФА) связывания. Кратко: GAL3 серийно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА), pH 7,4. Дубликатные пробы объемом 100 мкл вносили в лунки планшета, покрытые aHSG, и инкубировали в течение 2 ч при 37°C. После промывки буфером PBST лунки инкубировали в течение 1 ч с поликлональными антителами к GAL3, затем содержимое удаляли и проводили трехкратную промывку. Далее вносили вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP), после чего снова удаляли раствор и трехкратно промывали лунки. Добавляли субстратный раствор и инкубировали 15–25 мин при 37°C. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл стоп-раствора в каждую лунку и немедленно измеряли оптическую плотность при 450 нм. Результаты, представленные на Рисунке 1, демонстрируют дозозависимый характер связывания GAL3 и aHSG.

Белок GAL3 способен вызывать агглютинацию эритроцитов; для оценки этой активности использовали эритроциты кролика (RaE). Стандартная процедура анализа гемагглютинации (HA) включала двукратные серийные разведения рекомбинантного человеческого белка GAL3 в 0,01 М фосфатно-солевом буфере (PBS, pH 7,4). По 50 мкл каждого разведения вносили в лунки 96-луночного планшета с U- или V-образным дном; последнюю лунку использовали как отрицательный контроль, добавляя 50 мкл 0,01 М PBS без белка GAL3. Затем в каждую лунку добавляли по 50 мкл 1% суспензии эритроцитов кролика и осторожно перемешивали. Планшет инкубировали в течение 1–2 часов при комнатной температуре. Результаты представлены на рисунке 2: минимальная эффективная концентрация белка GAL3 составила 1,2 мкг/мл. (A) 1% суспензия RaE, обработанная 1,2 мкг/мл белка GAL3 в течение 2 ч; (B) отрицательный контроль без добавления белка GAL3.

На рисунке представлена реакция гемагглютинации GAL3, проведенная в 96-луночном микропланшете с V-образным дном.