Active Gremlin 1 (GREM1) (APC128Ra01)

Проведен анализ пролиферации для оценки биологической активности рекомбинантного крысиного белка GREM1 (ингибитора сигнального пути TGF-β) на клетках A549 и MCF-7. Клетки высевали в 96-луночные планшеты по 5000 клеток/лунку в трех повторностях, инкубировали до адгезии, затем среду заменяли на бессывороточную на ночь, после чего добавляли стандартную среду DMEM с 2% сыворотки и различные концентрации GREM1. После 96 часов инкубации пролиферацию оценивали с помощью набора CCK-8: в каждую лунку вносили 10 мкл раствора CCK-8, инкубировали 1–4 часа при 37 °C и измеряли оптическую плотность при 450 нм на планшетном ридере; также проводили микроскопию в инвертированном микроскопе. Установлено, что GREM1 достоверно повышает жизнеспособность клеток A549. На Рисунке 1 представлены результаты микроскопии клеток MCF-7 после 96-часовой стимуляции 0,001 нг/мл GREM1 (A) по сравнению с нестимулированным контролем (B).

На рисунке представлена пролиферация клеток MCF-7 после стимуляции белком GREM1.

Гремлин (GREM1) является ингибитором сигнального пути TGF-бета; антагонисты BMP, включая GREM1, играют важную роль в выживании и пролиферации стромы опухоли при различных злокачественных новообразованиях. Экспрессия данного белка обнаруживается при раке шейки матки, легких, яичников, почек, молочной железы, толстой кишки, поджелудочной железы и саркомах. Сообщается, что GREM1 и GREM2 подавляют активность некоторых генов-мишеней BMP, в связи с чем был проведен связывающий иммуноферментный анализ (ИФА) для детекции взаимодействия рекомбинантного крысиного GREM1 и рекомбинантного человеческого BMP2. Кратко: GREM1 серийно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА, pH 7,4). Дубликаты проб объемом 100 мкл вносили в лунки микропланшета, покрытые BMP2, и инкубировали в течение 2 ч при 37°C. После промывки буфером PBST лунки инкубировали в течение 1 ч с поликлональными антителами к GREM1, затем раствор удаляли и проводили трехкратную промывку. Далее проводили инкубацию с вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена (HRP), после чего раствор удаляли и выполняли пятикратную промывку. После добавления субстратного раствора лунки инкубировали в течение 15–25 мин при 37°C. В завершение в лунки добавляли по 50 мкл стоп-раствора и немедленно проводили измерение оптической плотности при длине волны 450 нм. Активность связывания GREM1 и BMP2 представлена на рисунке 3; значение EC50 для данного эффекта составило 1,042 мкг/мл.