Active Hepcidin (Hepc) (APB979Hu61)

Гепсидин (Hepc) является регулятором метаболизма железа, который ингибирует транспорт железа путем связывания с каналом экспорта железа ферропортином (FPN), расположенным на базолатеральной поверхности энтероцитов кишечника и плазматической мембране ретикулоэндотелиальных клеток (макрофагов), что в конечном итоге приводит к деградации белка-транспортера в лизосоме. Ингибирование ферропортина предотвращает экспорт железа, вызывая его секвестрацию в клетках. Поскольку ферропортин идентифицирован как партнер взаимодействия гепсидина, для детекции взаимодействия рекомбинантного человеческого Hepc и рекомбинантного человеческого FPN был проведен иммуноферментный анализ связывания. Кратко: Hepc серийно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с 0,01% БСА (pH 7,4). Дубликаты проб объемом 100 мкл вносили в лунки микропланшета, покрытые FPN, и инкубировали в течение 2 ч при 37°C. Лунки промывали PBST и инкубировали в течение 1 ч с поликлональными антителами к Hepc, после чего раствор удаляли и проводили трехкратную промывку. После инкубации с вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена (HRP), раствор удаляли и лунки промывали три раза. После добавления субстратного раствора лунки инкубировали в течение 15–25 мин при 37°C. Наконец, в лунки добавляли по 50 мкл стоп-раствора и немедленно проводили измерение оптической плотности при 450 нм. Активность связывания Hepc и FPN представлена на рисунке 1; данный эффект носил дозозависимый характер.