Active Hexosaminidase A Alpha (HEXa) (APA195Mu01)

Гексозаминидаза A альфа (HEXA) представляет собой лизосомальный фермент. Существует три основных изофермента: гексозаминидазы A, B и S. Гексозаминидаза A совместно с кофактором - белком-активатором GM2 - катализирует деградацию ганглиозидов GM2 и других молекул, содержащих терминальные N-ацетилгексозамины. Ферменты состоят из двух альфа- и/или бета-субъединиц, кодируемых генами HEXA и HEXB соответственно. Несмотря на то, что обе субъединицы (альфа и бета) гексозаминидазы A способны отщеплять остатки GalNAc, гидролиз ганглиозидов GM2 осуществляет только альфа-субъединица, содержащая ключевой остаток аргинина в положении 424 (Arg-424). Гексозаминидаза A (альфа-полипептид) играет критическую роль в функционировании головного и спинного мозга (центральной нервной системы). Поскольку было установлено, что гексозаминидаза B бета (HEXB) взаимодействует с HEXA, для детекции данного взаимодействия между рекомбинантной мышиной HEXA и рекомбинантной мышиной HEXB был проведен иммуноферментный анализ связывания (ELISA). Кратко: раствор HEXA серийно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА), pH 7,4. Дубликатные пробы объемом 100 мкл вносили в лунки планшета, покрытые HEXB, и инкубировали в течение 2 ч при 37 °C. После промывки лунок буфером PBST в них вносили поликлональные антитела к HEXA и инкубировали 1 ч, затем раствор удаляли и проводили трехкратную промывку. Далее добавляли вторичное антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP), после чего снова удаляли раствор и трехкратно промывали лунки. После внесения субстратного раствора лунки инкубировали в течение 15–25 мин при 37 °C. В завершение в лунки добавляли 50 мкл стоп-раствора и немедленно проводили измерение оптической плотности при длине волны 450 нм. Активность связывания HEXA и HEXB представлена на рисунке 1; данный эффект носил дозозависимый характер.

Результаты вестерн-блоттинга рекомбинантного белка HEXa мыши.