Active Hypoxia Inducible Factor 1 Alpha (HIF1a) (APA798Hu02)

Фактор, индуцируемый гипоксией 1-альфа (HIF1α), является субъединицей транскрипционного фактора, выполняющего функцию главного регулятора адаптивного ответа на гипоксию. Белок-шаперон теплового шока 90 (HSP90) выступает ключевым регулятором различных транскрипционных факторов, включая HIF1α, в связи с чем для детекции взаимодействия между HIF1α и HSP90 был проведен связывающий иммуноферментный анализ (ИФА). Кратко: рекомбинантный человеческий HIF1α серийно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА), pH 7,4. Дубликатные пробы объемом 100 мкл вносили в лунки планшета, покрытые HSP90, и инкубировали в течение 2 ч при 37°C. После промывки лунок буфером PBST проводили инкубацию с поликлональными антителами к HIF1α в течение 1 ч, после чего раствор удаляли и выполняли трехкратную промывку. Далее следовала инкубация с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP), с последующим удалением раствора и трехкратной промывкой. После внесения субстратного раствора лунки инкубировали в течение 15–25 мин при 37°C. В завершение в лунки добавляли 50 мкл стоп-раствора и немедленно проводили измерение оптической плотности при 450 нм. Активность связывания HIF1α и HSP90 представлена на рисунке 1; данный эффект носил дозозависимый характер.