Active Insulin (INS) (APA448Mu01)

Инсулин (INS) - пептидный гормон, продуцируемый бета-клетками островков поджелудочной железы, который снижает концентрацию глюкозы в крови и повышает проницаемость клеток для моносахаридов, аминокислот и жирных кислот. Сообщается, что связывание инсулина со своими рецепторами запускает фосфорилирование ряда субстратов, что играет важную роль в пролиферации клеток, прогрессии клеточного цикла, делении и дифференцировке. Для оценки влияния инсулина на пролиферацию клеток линию MCF-7 высевали в трех повторностях в лунки 96-луночных планшетов из расчета 2000 клеток на лунку и инкубировали в течение ночи для адгезии. Затем среду заменяли на стандартную среду DMEM без сыворотки и добавляли инсулин в различных концентрациях. После 48 часов инкубации клетки исследовали с помощью инвертированного микроскопа, а пролиферацию оценивали с использованием набора Cell Counting Kit-8 (CCK-8). Кратко: в каждую лунку планшета добавляли 10 мкл раствора CCK-8, после чего планшет инкубировали при 37°C в течение 1–4 часов и измеряли оптическую плотность при длине волны 450 нм на микропланшетном ридере.

На рисунке 2 представлена кривая зависимости «доза-эффект» для инсулина (INS). Было установлено, что инсулин достоверно стимулирует пролиферацию клеток линии MCF-7. Значение ED50 для данного эффекта составляет от 11,71 до 57,11 нг/мл.

Инсулин (INS) - полипептидный гормон, вырабатываемый бета-клетками поджелудочной железы и являющийся ключевым регулятором накопления и синтеза углеводов; он снижает концентрацию глюкозы в крови, повышает проницаемость клеток для моносахаридов, аминокислот и жирных кислот, а также ускоряет гликолиз, пентозофосфатный цикл и синтез гликогена в печени. Поскольку рецептор инсулина (INSR) идентифицирован как партнер взаимодействия с INS, был проведен функциональный иммуноферментный анализ (ИФА) для оценки связывания рекомбинантного мышиного INS с рекомбинантным крысиным INSR. Кратко: INS серийно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА, pH 7,4). Дубликаты проб объемом 100 мкл вносили в лунки планшета, покрытые INSR, и инкубировали в течение 2 ч при 37 °C. После промывки буфером PBST лунки инкубировали в течение 1 ч с поликлональными антителами к INS, затем раствор удаляли и проводили трехкратную промывку. Далее добавляли вторичное антитело, меченное пероксидазой хрена (HRP), после чего снова удаляли раствор и трехкратно промывали лунки. После внесения субстратного раствора лунки инкубировали 15–25 мин при 37 °C. В завершение в лунки добавляли по 50 мкл стоп-раствора и немедленно проводили измерение оптической плотности при 450 нм. Активность связывания рекомбинантного мышиного INS с рекомбинантным крысиным INSR представлена на рис. 1; значение EC50 составило 8,68 мкг/мл.