Active Insulin Like Growth Factor 1 (IGF1) (APA050Mu03)

Инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF1), также известный как соматомедин C, представляет собой гормон, сходный по молекулярной структуре с инсулином; он играет важную роль в росте в детском возрасте и сохраняет анаболические эффекты у взрослых. Синтетический аналог IGF1, мекасермин, применяется для лечения задержки роста. Поскольку белок, связывающий инсулиноподобный фактор роста 3 (IGFBP3), идентифицирован как партнер взаимодействия IGF1, был проведен связывающий иммуноферментный анализ (ИФА) для детекции взаимодействия рекомбинантного мышиного IGF1 и рекомбинантного крысиного IGFBP3. Кратко: IGF1 серийно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА, pH 7,4). Дубликаты проб объемом 100 мкл вносили в лунки микропланшета, покрытые IGFBP3, и инкубировали в течение 1 ч при 37 °C. Лунки промывали буфером PBST и инкубировали в течение 1 ч с поликлональными антителами к IGF1, после чего раствор удаляли и проводили трехкратную промывку. Затем лунки инкубировали с вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена (HRP), раствор удаляли и проводили пятикратную промывку. После добавления субстратного раствора лунки инкубировали в течение 15–25 мин при 37 °C. В завершение в лунки добавляли по 50 мкл стоп-раствора и немедленно проводили измерение оптической плотности при 450 нм. Активность связывания IGF1 и IGFBP3 представлена на рис. 1; эффект носил дозозависимый характер, значение EC50 составило 1,06 мкг/мл.

Для оценки влияния IGF1 на пролиферацию клеток клетки рака молочной железы MCF-7 высевали в трех повторностях в 96-луночные планшеты из расчета 5000 клеток на лунку и оставляли для адгезии; затем среду заменяли на бессывороточную на ночь, после чего вносили стандартную среду DMEM с 1% сыворотки перед добавлением рекомбинантного мышиного IGF1 в различных концентрациях. После 96 ч инкубации клетки исследовали с помощью инвертированного микроскопа, а пролиферацию оценивали с использованием набора Cell Counting Kit-8 (CCK-8). Кратко: в каждую лунку планшета добавляли 10 мкл раствора CCK-8, затем после инкубации планшета в течение 1–4 ч при 37°C измеряли оптическую плотность при длине волны 450 нм на планшетном ридере. Пролиферация клеток MCF-7 после 96 ч инкубации с IGF1, оцененная с помощью инвертированного микроскопа, представлена на рис. 1. Жизнеспособность клеток оценивали методом CCK-8 после 96 ч инкубации с рекомбинантным IGF1; результаты показаны на рис. 2. Было очевидно, что IGF1 достоверно повышал жизнеспособность клеток MCF-7.

На рисунке 3 показана пролиферация клеток MCF-7 после стимуляции инсулиноподобным фактором роста 1 (IGF1).