Active Interferon Gamma Induced Protein 10kDa (IP10) (APA371Hu01)

Проводили анализ связывания методом ИФА для оценки взаимодействия рекомбинантного человеческого белка IP10 (также известного как CXCL10) и рекомбинантного человеческого белка IGFBP7. IP10 представляет собой цитокин семейства CXC массой 8,7 кДа, секретируемый различными типами клеток в ответ на IFN-γ и участвующий в хемотаксисе моноцитов/макрофагов, Т-клеток, NK-клеток и дендритных клеток, адгезии Т-клеток к эндотелию, проявлении противоопухолевой активности, а также в ингибировании образования колоний костного мозга и ангиогенеза. Вкратце, VDR последовательно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 0,01% БСА (pH 7,4). Дубликаты проб объемом 100 мкл вносили в лунки планшета, покрытые IGFBP7, и инкубировали в течение 2 ч при 37°C. После промывки буфером PBST лунки инкубировали в течение 1 ч с поликлональными антителами к IP10, затем раствор удаляли и проводили трехкратную промывку. Далее проводили инкубацию с вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена (HRP), после чего раствор удаляли и лунки промывали три раза. После добавления субстратного раствора лунки инкубировали в течение 15–25 мин при 37°C. В завершение в лунки добавляли по 50 мкл стоп-раствора и немедленно измеряли оптическую плотность при 450 нм. Результаты, представленные на рисунке 1, демонстрируют дозозависимую активность связывания между IP10 и IGFBP7.

Для оценки хемотаксического эффекта белка IP10 на клеточную линию Raji использовали анализ хемотаксиса в 24-луночной системе микрохемотаксиса. Клетки Raji (суспензия объемом 150 мкл, концентрация 10⁶ клеток/мл в среде RPMI 1640 без добавления фетальной бычьей сыворотки) вносили в верхние камеры, а в нижние камеры добавляли IP10 (разведения 1, 10, 100 и 1000 нг/мл в среде RPMI 1640 без сыворотки); камеры были разделены поликарбонатным фильтром с размером пор 8 мкм. После инкубации при 37 °C в атмосфере с 5 % CO₂ в течение 2 ч фильтр удаляли, клетки в нижней камере визуализировали с помощью инвертированного микроскопа при малом увеличении (×100), а подсчет мигрировавших клеток проводили при большом увеличении (×400) случайным образом в пяти полях зрения для каждого фильтра. Результаты показали, что IP10 способен индуцировать миграцию клеток Raji. На рисунке 2 представлены мигрировавшие клетки Raji в нижней камере, визуализированные при малом увеличении (×100). Для статистического анализа в каждой камере случайным образом выбирали пять полей зрения и подсчитывали количество мигрировавших клеток при большом увеличении (×400); статистические данные приведены на рисунке 3. Оптимальная хемотаксическая активность IP10 наблюдалась в диапазоне концентраций 10–100 нг/мл. (A) Клетки Raji были помещены в верхние камеры, а в нижние камеры добавлена среда RPMI 1640 без сыворотки, содержащая IP10 в концентрации 10 нг/мл; клетки в нижней камере визуализированы при малом увеличении (×100) после 1 ч инкубации. (B) Клетки Raji были помещены в верхние камеры, а в нижние камеры добавлена среда RPMI 1640 без сыворотки и без IP10; клетки в нижней камере визуализированы при малом увеличении (×100) после 2 ч инкубации.

На рисунке представлен хемотаксический эффект белка IP10 на клетки линии Raji.