Функциональный ИФА для оценки связывания IL-32 с FGFR1
Интерлейкин-32 (IL-32) представляет собой цитокин, обычно ассоциированный с воспалительными процессами; его транскрипт экспрессируется в различных тканях и органах человека, включая селезенку, тимус, лейкоциты, легкие, тонкий и толстый кишечник, предстательную железу, сердце, плаценту, печень, мышцы, почки, поджелудочную железу и мозг. Цитокины являются ключевыми компонентами путей клеточной сигнализации, участвующих в регуляции роста клеток, метаболизма, гормональной сигнализации, иммунного ответа и ряда других физиологических функций. Поскольку FGFR1 идентифицирован как партнер взаимодействия IL-32, был проведен функциональный иммуноферментный анализ (ИФА) связывания для детекции взаимодействия рекомбинантного человеческого IL-32 и рекомбинантного человеческого FGFR1. Кратко: IL-32 серийно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА, pH 7,4). Дубликаты проб объемом 100 мкл вносили в лунки микропланшета, покрытые FGFR1, и инкубировали в течение 1 ч при 37 °C. Лунки промывали буфером PBST и инкубировали в течение 1 ч с поликлональными антителами к IL-32, после чего раствор удаляли и проводили трехкратную промывку. Далее лунки инкубировали с вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена (HRP), в течение 1 ч при 37 °C, после чего раствор удаляли и проводили пятикратную промывку. После добавления субстратного раствора лунки инкубировали в течение 15–25 мин при 37 °C. В завершение в лунки добавляли по 50 мкл стоп-раствора и немедленно проводили измерение оптической плотности при длинах волн 450/630 нм. Активность связывания рекомбинантного человеческого IL-32 с рекомбинантным человеческим FGFR1 представлена на рис. 1; значение EC50 для данного эффекта составило 0,15 мкг/мл.
