Active Interleukin 8 (IL8) (APA080Hu01)

На рисунке представлена активность связывания интерлейкина-8 (IL8, также известного как хемокин (C-X-C мотив) лиганд 8, CXCL8) с синдеканом-1 (SDC1). IL8 является хемокином, продуцируемым макрофагами и другими типами клеток, такими как эпителиальные клетки, клетки гладкой мускулатуры дыхательных путей и эндотелиальные клетки. IL8, также называемый фактором хемотаксиса нейтрофилов, выполняет две основные функции: индуцирует хемотаксис целевых клеток (преимущественно нейтрофилов, а также других гранулоцитов), вызывая их миграцию к очагу инфекции, и стимулирует фагоцитоз после их прибытия. Кроме того, IL8 является мощным стимулятором ангиогенеза. Поскольку синдекан-1 (SDC1) идентифицирован как партнер взаимодействия IL8, для детекции взаимодействия рекомбинантного человеческого IL8 и рекомбинантного человеческого SDC1 был проведен иммуноферментный анализ (ИФА) связывания. Кратко: IL8 серийно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА, pH 7,4). Дубликаты проб объемом 100 мкл вносили в лунки микропланшета, покрытые SDC1, и инкубировали в течение 2 ч при 37°C. Лунки промывали буфером PBST и инкубировали в течение 1 ч с поликлональными антителами к IL8, после чего раствор удаляли и проводили трехкратную промывку. После инкубации с вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена (HRP), раствор удаляли и лунки трижды промывали. После добавления субстратного раствора лунки инкубировали в течение 15–25 мин при 37°C. В завершение в лунки добавляли по 50 мкл стоп-раствора и немедленно проводили измерение оптической плотности при 450 нм. Активность связывания IL8 и SDC1 представлена на рисунке 1; данный эффект носил дозозависимый характер.

ИЛ-8 является фактором хемотаксиса нейтрофилов. Для оценки хемотаксического эффекта ИЛ-8 на линию клеток Т-клеточного лейкоза человека Jurkat был проведен анализ хемотаксиса с использованием 24-луночной системы микрохемотаксиса. Кратко: клетки Jurkat высевали в верхние камеры (100 мкл клеточной суспензии, 10⁶ клеток/мл в среде RPMI 1640 без добавления фетальной бычьей сыворотки), а рекомбинантный человеческий ИЛ-8 (10 нг/мл, 100 нг/мл и 1000 нг/мл, разведенные отдельно в среде RPMI 1640 без сыворотки) добавляли в нижние камеры; разделение камер осуществлялось с помощью поликарбонатного фильтра с размером пор 8 мкм. После инкубации при 37 °C в атмосфере 5% CO₂ в течение 1 ч фильтр удаляли, затем клетки в нижних камерах наблюдали под инвертированным микроскопом при малом увеличении (×100), а количество мигрировавших клеток подсчитывали при большом увеличении (×400) случайным образом (по пять полей зрения на каждый фильтр). Результаты показали, что ИЛ-8 способен индуцировать миграцию клеток Jurkat. На рисунке 2 представлены мигрировавшие клетки Jurkat в нижних камерах, наблюдаемые при малом увеличении (×100). Для каждого образца случайным образом выбирали пять полей зрения, после чего проводили подсчет мигрировавших клеток при большом увеличении (×400). Статистические результаты представлены на рисунке 3. Оптимальная хемотаксическая активность ИЛ-8 наблюдается в диапазоне концентраций 10–100 нг/мл. (A) Клетки Jurkat высевали в верхние камеры, а в нижние камеры добавляли среду RPMI 1640 без сыворотки, содержащую 10 нг/мл ИЛ-8; затем после 1 ч инкубации клетки в нижних камерах наблюдали при малом увеличении (×100). (B) Клетки Jurkat высевали в верхние камеры, а в нижние камеры добавляли среду RPMI 1640 без сыворотки, не содержащую ИЛ-8; затем после 1 ч инкубации клетки в нижних камерах наблюдали при малом увеличении (×100).

На рисунке показано хемотаксическое действие IL8 на клетки Jurkat.