Active Klotho (KL) (APH757Ra01)

Белок Klotho (KL) представляет собой трансмембранный белок, который, помимо других функций, регулирует чувствительность организма к инсулину и участвует в процессах старения. Белок Klotho является новой β-глюкуронидазой, способной гидролизовать стероидные β-глюкурониды. Генетические варианты гена KLOTHO ассоциированы со старением человека, а сам белок Klotho обнаруживается в сыворотке крови как циркулирующий фактор, концентрация которого снижается с возрастом. Взаимодействие β-Klotho в качестве корецептора способствует связыванию определенных факторов роста фибробластов (FGF), а именно FGF19, FGF20 и FGF23, с их рецепторами. Кроме того, фактор роста фибробластов 23 (FGF23) идентифицирован как партнер взаимодействия KL; в связи с этим был проведен иммуноферментный анализ (ИФА) связывания для детекции взаимодействия рекомбинантного крысиного KL и рекомбинантного крысиного FGF23. Кратко: KL серийно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА, pH 7,4). Дубликаты проб объемом 100 мкл вносили в лунки микропланшета, покрытые FGF23, и инкубировали в течение 2 ч при 37°C. Лунки промывали буфером PBST и инкубировали в течение 1 ч с поликлональными антителами против KL, после чего раствор удаляли и проводили трехкратную промывку. После инкубации с вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена (HRP), раствор удаляли и лунки трехкратно промывали. После добавления субстратного раствора лунки инкубировали в течение 15–25 мин при 37°C. В завершение в лунки добавляли по 50 мкл стоп-раствора и немедленно проводили измерение оптической плотности при длине волны 450 нм. Активность связывания KL и FGF23 представлена на рисунке 1; данный эффект носил дозозависимый характер. Активность связывания KL с FGF23.