Active Lysyl Oxidase (LOX) (APC580Hu01)

Лизилоксидаза (LOX), также известная как протеин-лизин-6-оксидаза, представляет собой внеклеточный медьзависимый фермент, катализирующий образование альдегидов из остатков лизина в предшественниках коллагена и эластина. Ее каталитическая активность зависит как от кофактора меди, так и от уникального карбонильного кофактора; показано, что субстратная специфичность фермента распространяется на различные основные глобулярные белки, включая гистон H1. LOX играет ключевую роль в развитии соединительной ткани и, возможно, важна для неврологических функций. Лизилоксидаза также имеет критическое значение для развития дыхательной системы и кожи, дифференцировки адипоцитов и формирования плюрипотентных стволовых клеток в процессе развития. Отсутствие LOX может приводить к дефектам в сигнальном пути суперсемейства трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), регулирующего рост и дифференцировку клеток. Поскольку эластин (ELN) идентифицирован как белок-партнер LOX, был проведен связывающий иммуноферментный анализ (ИФА) для детекции взаимодействия рекомбинантного человеческого LOX и рекомбинантного человеческого ELN. Кратко: LOX серийно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА, pH 7,4). Дубликатные пробы объемом 100 мкл вносили в лунки планшета, покрытые эластином, и инкубировали в течение 2 ч при 37 °C. После промывки лунок буфером PBST их инкубировали в течение 1 ч с поликлональными антителами к LOX, затем содержимое удаляли и проводили трехкратную промывку. После инкубации с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP), лунки снова промывали трехкратно. Добавляли субстратный раствор и инкубировали лунки в течение 15–25 мин при 37 °C. В завершение в лунки добавляли по 50 мкл стоп-раствора и немедленно измеряли оптическую плотность при длине волны 450 нм. Активность связывания LOX и ELN представлена на рисунке 1; наблюдалась дозозависимая динамика взаимодействия.