Active Mdm2 p53 Binding Protein Homolog (MDM2) (APG790Hu01)

Гомолог мышиного белка double minute 2 (MDM2), также известный как E3-убиквитин-протеинлигаза, представляет собой клеточный онкобелок. Он распознает N-концевой домен трансактивации (TAD) опухолевого супрессора p53 и ингибирует его транскрипционную активность. Человеческий гомолог этого белка иногда обозначается как Hdm2. Ключевой мишенью MDM2 является опухолевый супрессор p53; MDM2 идентифицирован как белок, взаимодействующий с p53, подавляющий его транскрипционную активность и функционирующий как E3-убиквитинлигаза, направляющая как себя, так и p53 на деградацию протеасомой. MDM2 способен к автополиубиквитинированию, а в комплексе с p300 (содействующей E3-убиквитинлигазой) осуществляет полиубиквитинирование p53. Кроме того, кальций-связывающий белок S100 идентифицирован как партнер взаимодействия MDM2. В связи с этим был проведен иммуноферментный анализ (ELISA) связывания для детекции взаимодействия рекомбинантного человеческого MDM2 и рекомбинантного человеческого S100. Кратко: MDM2 серийно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА), pH 7,4. Дубликатные пробы объемом 100 мкл вносили в лунки планшета, покрытые белком S100, и инкубировали в течение 2 ч при 37 °C. Лунки промывали буфером PBST и инкубировали в течение 1 ч с поликлональными антителами к MDM2, после чего содержимое удаляли и проводили трехкратную промывку. Затем добавляли вторичные антитела, меченные пероксидазой хрена (HRP), удаляли раствор и снова промывали лунки три раза. После внесения субстратного раствора лунки инкубировали в течение 15–25 мин при 37 °C. Наконец, в лунки добавляли 50 мкл стоп-раствора и немедленно проводили измерение оптической плотности при 450 нм. Активность связывания рекомбинантного человеческого MDM2 и рекомбинантного человеческого S100 представлена на рисунке 1; значение EC50 составило 0,037 мкг/мл.