Active NADH Dehydrogenase, Quinone 1 (NQO1) (APL969Hu01)

НАДФ(Н):хинон-акцепторная оксидоредуктаза 1 (NQO1), также известная как DT-диафораза, представляет собой широко распространенный ФАД-зависимый флавопротеин, катализирующий двухэлектронное восстановление хинонов, хинониминов, нитроароматических соединений и азокрасителей, тем самым предотвращая одноэлектронное восстановление хинонов с образованием радикальных видов. NQO1 является высокоиндуцибельным ферментом, регуляция которого осуществляется через путь Keap1/Nrf2/ARE. Повышение и снижение уровня NQO1 ассоциированы соответственно со снижением и повышением чувствительности к окислительному стрессу, что делает NQO1 маркерным цитопротекторным ферментом при окислительном стрессе. Независимо от своей каталитической функции, NQO1 участвует в регуляции протеасомной деградации белков p53, p73a и p33, физически взаимодействуя с p53 и p73 в НАДН-зависимом режиме и защищая их от деградации 20S протеасомой по убиквитин-независимому пути. Активность рекомбинантного человеческого NQO1 оценивали по способности окислять субстрат резазурин до резоруфина. Рекомбинантный человеческий NQO1 (rhNQO1) разводили до концентрации 100 мкг/мл в assay-буфере (50 мМ HEPES, 0,2 М NaCl, 5 мкМ ФАД, 0,05% Tween 20, pH 7,5). В лунки микропланшета вносили 50 мкл раствора rhNQO1 (100 мкг/мл) и инициировали реакцию добавлением 50 мкл субстратной смеси, содержащей 400 мкМ бета-НАДН и 20 мкМ резазурина, приготовленной в assay-буфере. Измерения проводили в кинетическом режиме в течение 5 минут, регистрируя флуоресценцию при длинах волн возбуждения 540 нм и испускания 585 нм (считывание сверху). Удельная активность рекомбинантного человеческого NQO1 составляет >18 пмоль/мин/мкг.