Active Nesfatin 1 (NES1) (APA242Mu01)

Белок Nucb2 (нуклеобиндин-2), являющийся кальций-связывающим белком, подвергается протеолитическому расщеплению с образованием пептида NES1 (несфатин-1). NES1 представляет собой анорексигенный пептид, который, по-видимому, участвует в гипоталамических путях регуляции потребления пищи и энергетического гомеостаза, действуя независимым от лептина образом. В качестве партнера по взаимодействию с Nucb2 был идентифицирован белок GADD45A (индуцируемый остановкой роста и повреждением ДНК белок GADD45 альфа). Кроме того, аминокислотная последовательность крысиного GADD45A демонстрирует 98% гомологию с мышиным NES1. В связи с этим был проведен связывающий иммуноферментный анализ (ИФА) для детекции взаимодействия между рекомбинантным мышиным NES1 и рекомбинантным крысиным GADD45A. Кратко: NES1 серийно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА), pH 7,4. Дубликатные пробы NES1 объемом 100 мкл вносили в лунки планшета, покрытые GADD45A, и инкубировали в течение 2 ч при 37°C. После промывки лунок буфером PBST проводили инкубацию с поликлональными антителами к NES1 в течение 1 ч, затем раствор удаляли и лунки промывали трижды. Далее следовала инкубация с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP), после чего лунки снова аспирировали и промывали трижды. После внесения субстратного раствора лунки инкубировали в течение 15–25 мин при 37°C. В завершение в лунки добавляли 50 мкл стоп-раствора и немедленно проводили измерение оптической плотности при 450 нм. Активность связывания NES1 и GADD45A представлена на рисунке 1; данный эффект носил дозозависимый характер.

Результаты вестерн-блоттинга с использованием рекомбинантного белка NES1 мыши в качестве образца.