Active Nesfatin 1 (NES1) (APA242Ra01)

Нуклеобиндин-2 (Nucb2), кальций-связывающий белок, подвергается протеолитическому расщеплению с образованием несфатина-1 (NES1). NES1 представляет собой анорексигенный пептид, который, по-видимому, участвует в гипоталамических путях регуляции потребления пищи и энергетического гомеостаза, действуя независимым от лептина образом. В качестве партнера взаимодействия для Nucb2 был идентифицирован белок GADD45A (белок остановки роста и индукции повреждения ДНК альфа), а для NES1 - белок GADD45b (бета). Для детекции взаимодействия рекомбинантного крысиного NES1 и рекомбинантного крысиного GADD45b был проведен иммуноферментный анализ связывания (ELISA). Кратко: NES1 серийно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА, pH 7,4). Дубликаты проб объемом 100 мкл вносили в лунки планшета, покрытые GADD45b, и инкубировали в течение 2 ч при 37 °C. После промывки буфером PBST лунки инкубировали в течение 1 ч с поликлональными антителами к NES1, затем раствор удаляли и проводили трехкратную промывку. Далее проводили инкубацию с вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена (HRP), после чего снова удаляли раствор и трехкратно промывали лунки. После добавления субстратного раствора лунки инкубировали в течение 15–25 мин при 37 °C. В завершение в лунки добавляли по 50 мкл стоп-раствора и немедленно проводили измерение оптической плотности при 450 нм. Активность связывания NES1 и GADD45b представлена на рис. 1; данный эффект носил дозозависимый характер. Активность связывания NES1 с GADD45b.