Active Ornithine Decarboxylase (ODC) (APB332Ra01)

Фермент орнитиндекарбоксилаза (ODC) катализирует декарбоксилирование орнитина с образованием путресцина; данный этап является лимитирующей стадией синтеза полиаминов. Лизин-69 в составе ODC связывает кофактор пиридоксальфосфат (PLP) с образованием шиффова основания, которое затем замещается орнитином с формированием шиффова основания, связанного с ODC; после декарбоксилирования образуется хиноидный интермедиат, перегруппировка которого приводит к образованию шиффова основания с путресцином, атакуемого лизином с высвобождением продукта и регенерацией PLP-связанной формы ODC. Поскольку тимидинкиназа 1 растворимая (TK1) идентифицирована как партнер взаимодействия ODC, для детекции связывания рекомбинантной крысиной ODC и рекомбинантной крысиной TK1 был проведен иммуноферментный анализ (ИФА). Кратко: ODC серийно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА, pH 7,4). Дубликатные пробы объемом 100 мкл вносили в лунки планшета, покрытые TK1, и инкубировали в течение 2 ч при 37 °C. После промывки буфером PBST лунки инкубировали в течение 1 ч с поликлональными антителами к ODC, затем раствор удаляли и проводили трехкратную промывку. Далее добавляли вторичные антитела, меченные пероксидазой хрена (HRP), после чего снова удаляли раствор и трехкратно промывали лунки. После внесения субстратного раствора лунки инкубировали 15–25 мин при 37 °C. В завершение добавляли 50 мкл стоп-раствора и немедленно измеряли оптическую плотность при 450 нм. Результаты, представленные на рисунке 1, демонстрируют дозозависимое связывание ODC с TK1.