Active Perforin 1 (PRF1) (APB317Hu01)

Перфорин-1 (PRF1) представляет собой формирующий поры цитолитический белок, содержащийся в гранулах цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) и NK-клеток. После дегрануляции перфорин связывается с плазматической мембраной клетки-мишени и в зависимости от концентрации ионов Ca2+ олигомеризуется с образованием пор, обеспечивающих пассивную диффузию семейства проапоптотических протеаз (гранзимов) в клетку-мишень. Поскольку кальретикулин (CRT) идентифицирован как партнер взаимодействия PRF1, для детекции связывания рекомбинантного человеческого PRF1 и рекомбинантного человеческого CRT был проведен иммуноферментный анализ (ИФА). Кратко: PRF1 серийно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 0,01% БСА (pH 7,4). Дубликаты проб объемом 100 мкл вносили в лунки микропланшета, покрытые CRT, и инкубировали в течение 2 ч при 37°C. Лунки промывали буфером PBST и инкубировали в течение 1 ч с поликлональными антителами к PRF1, после чего раствор удаляли и проводили трехкратную промывку. После инкубации с вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена (HRP), раствор удаляли и лунки трехкратно промывали. После добавления субстратного раствора лунки инкубировали в течение 15–25 мин при 37°C. В завершение в лунки добавляли по 50 мкл стоп-раствора и немедленно проводили измерение оптической плотности при 450 нм. Активность связывания PRF1 и CRT представлена на рисунке 1; наблюдалась дозозависимая динамика эффекта.

Активность рекомбинантного перфорина человека (PRF1) оценивали в тесте на гемолиз эритроцитов. Общая процедура включала двукратные разведения рекомбинантного PRF1 в 0,9% растворе NaCl; в каждую лунку вносили 50 мкл серийных разведений PRF1, 10 мкл 0,1 М CaCl2 и 50 мкл 0,25% суспензии эритроцитов кролика (RaE), после чего содержимое аккуратно перемешивали. В контрольные лунки вместо CaCl2 добавляли 10 мкл 0,9% NaCl. Планшет инкубировали в течение 20 ч при 37°C в атмосфере 5% CO2. Результаты представлены на рисунке 2. Минимальная эффективная концентрация PRF1 составила 12,5 мкг/мл. (A) 0,25% суспензия RaE, обработанная 12,5 мкг/мл PRF1 в течение 20 ч; (B) отрицательный контроль (0,25% суспензия RaE, обработанная 12,5 мкг/мл PRF1) без добавления CaCl2.