Active Plasminogen Activator, Urokinase Receptor (uPAR) (APA141Hu04)

Рецептор урокиназного активатора плазминогена (uPAR) представляет собой белок, заякоренный через гликозилфосфатидилинозитол (GPI). Помимо регуляции протеолиза, uPAR способен активировать множество внутриклеточных сигнальных путей, способствующих миграции, инвазии, пролиферации и выживанию клеток, взаимодействуя с трансмембранными рецепторами. uPAR сверхэкспрессируется при различных типах опухолей и ассоциирован с инвазией и метастазированием рака. Поскольку ITGb1 идентифицирован как партнер взаимодействия uPAR, был проведен функциональный ИФА связывания для детекции взаимодействия рекомбинантного человеческого uPAR и рекомбинантного человеческого ITGb1. Кратко: uPAR серийно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с 0,01% БСА (pH 7,4). Дубликаты проб объемом 100 мкл вносили в лунки микропланшета, покрытые ITGb1, и инкубировали в течение 1 ч при 37 °C. Лунки промывали буфером PBST и инкубировали в течение 1 ч с поликлональными антителами к uPAR, после чего раствор удаляли и проводили трехкратную промывку. После инкубации с вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена (HRP), в течение 1 ч при 37 °C, раствор удаляли и проводили пятикратную промывку. После добавления субстратного раствора лунки инкубировали в течение 15–25 мин при 37 °C. В завершение в лунки добавляли по 50 мкл стоп-раствора и немедленно проводили измерение оптической плотности при длинах волн 450/630 нм. Активность связывания рекомбинантного человеческого uPAR и рекомбинантного человеческого ITGb1 представлена на рис. 1; значение EC50 для данного эффекта составило 0,165 мкг/мл.