Active Protein Kinase R (PKR) (APA520Hu01)

Белок-киназа R (PKR) активируется двуцепочечной РНК (дцРНК), синтез которой индуцируется вирусной инфекцией. Активация PKR также может осуществляться белком PACT или гепарином. Данный фермент играет ключевую роль в врожденном иммунном ответе на вирусные инфекции, а также участвует в регуляции сигнальной трансдукции, апоптоза, клеточной пролиферации и дифференцировки. Поскольку циклин-зависимая киназа 1 (CDK1) была идентифицирована как белок-партнер PKR, для детекции их взаимодействия был проведен иммуноферментный анализ связывания (ELISA) с использованием рекомбинантного человеческого PKR и рекомбинантного человеческого CDK1. Кратко: раствор PKR серийно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащем 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА), pH 7,4. Аликвоты объемом 100 мкл в двух повторностях вносили в лунки планшета, покрытые CDK1, и инкубировали в течение 2 ч при 37°C. После промывки буфером PBST лунки инкубировали в течение 1 ч с поликлональными антителами к PKR, затем содержимое удаляли и проводили трехкратную промывку. Далее следовала инкубация с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP), после чего снова выполняли удаление раствора и трехкратную промывку. После добавления субстратного раствора лунки инкубировали в течение 15–25 мин при 37°C. В завершение в лунки добавляли по 50 мкл стоп-раствора и немедленно проводили измерение оптической плотности при длине волны 450 нм. Результаты, представленные на Рисунке 1, демонстрируют связывание PKR с CDK1, которое носит дозозависимый характер.