Active Pyruvate kinase isozymes M2 (PKM2) (APA588Hu02)

Пировиноградная киназа мышечного типа (PKM2) является одной из четырех изоформ пировиноградной киназы; у позвоночных выделяют изоформы L (печень), R (эритроциты), M1 (мышцы, сердце и мозг) и M2 (обнаруживается в ранних эмбриональных тканях и присутствует в большинстве тканей взрослых организмов). Пировиноградная киназа катализирует заключительный этап гликолиза, перенося фосфатную группу с фосфоенолпирувата (ФЕП) на аденозиндифосфат (АДФ) с образованием пирувата и АТФ. Поскольку белок PIN1 (пептидилпролилизомераза, взаимодействующая с NIMA) идентифицирован как партнер взаимодействия PKM2, для детекции связывания рекомбинантного человеческого PKM2 и рекомбинантного человеческого PIN1 был проведен иммуноферментный анализ (ИФА). Кратко: PKM2 серийно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с 0,01% БСА (pH 7,4). Дубликатные пробы объемом 100 мкл вносили в лунки планшета, покрытые PIN1, и инкубировали в течение 2 ч при 37°C. После промывки буфером PBST лунки инкубировали в течение 1 ч с поликлональными антителами к PKM2, затем раствор удаляли и проводили трехкратную промывку. После инкубации с вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена (HRP), раствор удаляли и лунки промывали три раза. Добавляли субстратный раствор и инкубировали 15–25 мин при 37°C. В завершение в лунки добавляли по 50 мкл стоп-раствора и немедленно измеряли оптическую плотность при 450 нм. Результаты, представленные на рисунке 1, демонстрируют дозозависимую активность связывания PKM2 и PIN1.