Связывание рекомбинантного белка RBP4 с ретиноевой кислотой
Белок, связывающий ретинол 4 (RBP4), является специфическим переносчиком ретинола (витамина А) и отвечает за преобразование нестабильного и нерастворимого в воде ретинола в стабильный растворимый комплекс в плазме благодаря прочному взаимодействию. Будучи членом суперсемейства липокалинов и обладая структурой типа β-бочонка с четко определенной полостью, RBP4 секретируется печенью и доставляет ретинол из печеночных запасов в периферические ткани. В плазме комплекс RBP4-ретинол взаимодействует с транстиретином (TTR); это связывание критически важно для предотвращения выведения RBP4 через почечные клубочки. RBP4, экспрессируемый из эктопического источника, эффективно доставляет ретинол в глаза, а его дефицит существенно нарушает ночное зрение. В последнее время установлено, что RBP4, функционирующий как адипокин, экспрессируется в жировой ткани и коррелирует с ожирением, инсулинорезистентностью (ИР) и сахарным диабетом 2 типа (СД2). Активность рекомбинантного человеческого RBP4 оценивали по его способности связывать полностью транс-ретиноевую кислоту. Связывание ретиноевой кислоты приводит к тушению флуоресценции триптофана в RBP4. RBP4 разводили до концентрации 50 мкг/мл в буферном растворе (50 мМ Tris, 10 мМ CaCl2, 150 мМ NaCl, pH 7,5), а ретиноевую кислоту последовательно разводили до концентраций 100, 30, 10, 3 и 1 мкМ в 95% этаноле. Смешивали 112,5 мкл раствора rhRBP4 (50 мкг/мл) и 12,5 мкл серийных разведений ретиноевой кислоты в микропробирках; в качестве холостой пробы использовали смесь 112,5 мкл раствора rhRBP4 (50 мкг/мл) и 12,5 мкл 95% этанола, после чего инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Вносили по 100 мкл реакционных смесей и холостой пробы и проводили измерения в конечной точке при длинах волн возбуждения 280 нм и испускания 340 нм (считывание сверху). Результаты представлены на рисунке 1; концентрация 50% связывания (BC50) составляет >30 мкМ.
