Active Secreted Frizzled Related Protein 1 (SFRP1) (APF880Ra01)

Секретированный белок, родственный Frizzled-1 (SFRP1), являющийся членом семейства SFRP и содержащий богатый цистеином домен, гомологичный предполагаемому сайту связывания Wnt белков Frizzled, выступает в качестве бифазного модулятора Wnt-сигнализации: он подавляет индуцированные Wnt эффекты при высоких концентрациях и способствует им при низких. Будучи супрессором опухолевого роста, SFRP1 достоверно ингибирует пролиферацию опухолевых клеток в культуре, в мягком агаре и в ксенотрансплантатах у атимических мышей линии nude. Поскольку установлено взаимодействие между SFRP1 и белком Wingless Type MMTV Integration Site Family, Member 2 (WNT2), был проведен иммуноферментный анализ (ИФА) для детекции связывания рекомбинантного крысиного SFRP1 с рекомбинантным крысиным WNT2. Кратко: SFRP1 серийно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА, pH 7,4). Дубликаты проб объемом 100 мкл вносили в лунки планшета, покрытые WNT2, и инкубировали в течение 2 ч при 37°C. После промывки буфером PBST лунки инкубировали в течение 1 ч с поликлональными антителами к SFRP1, затем раствор удаляли и проводили трехкратную промывку. Далее добавляли вторичные антитела, меченные пероксидазой хрена (HRP), после чего снова удаляли раствор и трехкратно промывали лунки. После внесения субстратного раствора лунки инкубировали в течение 15–25 мин при 37°C. В завершение в лунки добавляли по 50 мкл стоп-раствора и немедленно проводили измерение оптической плотности при 450 нм. Активность связывания SFRP1 с WNT2 представлена на рис. 1; наблюдалась дозозависимая динамика этого эффекта. Рис. Активность связывания SFRP1 с WNT2.

Для оценки способности SFRP1 подавлять опухолевый рост клетки гепатоцеллюлярной карциномы HepG2 высевали в трех повторностях в 96-луночные планшеты с плотностью 5000 клеток/лунку и оставляли для адгезии; после инкубации в течение ночи в среде без сыворотки среду заменяли на стандартную DMEM с добавлением 2% сыворотки перед внесением рекомбинантного крысиного SFRP1 в различных концентрациях. После 96 часов инкубации клетки исследовали с помощью инвертированного микроскопа, а пролиферацию клеток оценивали с использованием набора CCK-8. Кратко: в каждую лунку планшета добавляли 10 мкл раствора CCK-8, затем после инкубации планшета в течение 1–4 часов при 37°C измеряли оптическую плотность при длине волны 450 нм на микропланшетном ридере. На Рисунке 2 представлено подавление роста клеток HepG2 после 96-часовой инкубации с SFRP1, наблюдаемое с помощью инвертированного микроскопа. На Рисунке 3 показаны результаты оценки жизнеспособности клеток методом CCK-8 после 96-часовой инкубации с рекомбинантным SFRP1. Было очевидно, что SFRP1 достоверно снижал жизнеспособность клеток HepG2. (A) Клетки HepG2, культивируемые в среде DMEM и стимулированные SFRP1 в концентрации 1000 нг/мл в течение 96 ч; (B) Нестимулированные клетки HepG2, культивируемые в среде DMEM в течение 96 ч. Подавление роста клеток HepG2 после стимуляции SFRP1.

На рисунке представлено подавление роста клеток HepG2 после стимуляции белком SFRP1.