Active Semaphorin 3A (SEMA3A) (APL917Hu02)

Семафорин 3A (SEMA3A), относящийся к семейству семафоринов, может функционировать как хеморепеллент, ингибирующий рост аксонов, или как хемоаттрактант, стимулирующий рост апикальных дендритов; в обоих случаях этот белок жизненно важен для нормального формирования нейрональных структур. SEMA3A представляет собой секретируемый белок, содержащий Sema-домен, иммуноглобулиновый домен типа C2 и основной домен вблизи карбоксильного конца. Он секретируется нейронами и окружающими тканями для направления миграции клеток и роста аксонов в развивающейся нервной системе. Поскольку было установлено, что нейропилин-1 (NRP1) взаимодействует с SEMA3A, для детекции взаимодействия рекомбинантного человеческого SEMA3A и рекомбинантного человеческого NRP1 был проведен иммуноферментный анализ связывания (ELISA). Кратко: SEMA3A последовательно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА, pH 7,4). Дубликатные пробы объемом 100 мкл вносили в лунки планшета, покрытые NRP1, и инкубировали в течение 2 ч при 37 °C. Лунки промывали буфером PBST и инкубировали в течение 1 ч с поликлональными антителами к SEMA3A, после чего раствор удаляли и проводили трехкратную промывку. Затем лунки инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (HRP), после чего снова удаляли раствор и трехкратно промывали. После добавления субстратного раствора лунки инкубировали в течение 15–25 мин при 37 °C. В завершение в лунки добавляли по 50 мкл стоп-раствора и немедленно измеряли оптическую плотность при длине волны 450 нм. Активность связывания SEMA3A и NRP1 представлена на рисунке 1; данный эффект носил дозозависимый характер.

Вестерн-блоттинг; образец: рекомбинантный белок SEMA3A человека.