Active Sirtuin 3 (SIRT3) (APE913Ra01)

Белок сиртуин 3 (SIRT3), являющийся NAD-зависимой деацетилазой и членом семейства сиртуинов млекопитающих, выполняет разнообразные молекулярные функции, включая регуляцию старения, устойчивости к стрессу и метаболизма. Митохондриальная изоцитратдегидрогеназа 2 (IDH2) идентифицирована как белок-партнер SIRT3. Для детекции взаимодействия между рекомбинантным крысиным SIRT3 и рекомбинантным крысиным IDH2 был проведен иммуноферментный анализ связывания (ELISA). Кратко: SIRT3 серийно разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS) с добавлением 0,01% бычьего сывороточного альбумина (БСА, pH 7,4). Дубликатные пробы объемом 100 мкл вносили в лунки планшета, покрытые IDH2, и инкубировали в течение 2 ч при 37 °C. После промывки буфером PBST лунки инкубировали в течение 1 ч с поликлональными антителами к SIRT3, затем содержимое удаляли и проводили трехкратную промывку. Далее вносили вторичные антитела, меченные пероксидазой хрена (HRP), после чего снова удаляли раствор и промывали лунки три раза. Добавляли субстратный раствор и инкубировали 15–25 мин при 37 °C. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл стоп-раствора в каждую лунку и немедленно измеряли оптическую плотность при 450 нм. Результаты, представленные на Рисунке 1, демонстрируют дозозависимый характер связывания SIRT3 и IDH2.