Active Tissue Inhibitors Of Metalloproteinase 3 (TIMP3) (APA129Hu01)

Тканевой ингибитор металлопротеиназ 3 (TIMP3) относится к семейству тканевых ингибиторов металлопротеиназ и подавляет активность матриксных металлопротеиназ. TIMP-3 является единственным представителем этого семейства, локализованным исключительно во внеклеточном матриксе (ВКМ); его экспрессия регулируется в зависимости от фазы клеточного цикла в определенных типах клеток, что позволяет использовать его в качестве маркера терминальной дифференцировки. Активность рекомбинантного человеческого TIMP3 оценивали по его способности ингибировать расщепление флуорогенного пептидного субстрата Mca-PLGL-Dpa-AR-NH2 рекомбинантным человеческим MMP2. Анализ проводили в буферном растворе следующего состава: 50 мМ Tris, 10 мМ CaCl2, 150 мМ NaCl, 0,05% Brij-35 (об./об.), pH 7,5. Рекомбинантный человеческий MMP-2 (APA100Hu61) активировали 1 мМ APMA при 37 °C в течение 1 часа. Затем смесь, содержащую 16 мкл rhTIMP-3 (концентрация 126 мкг/мл), 25,6 мкл rhMMP-2 (концентрация 100 мкг/мл) и 118,4 мкл буфера для анализа, инкубировали в течение 2 часов при 37 °C. Контроль (в двух повторностях) содержал буфер для анализа и разведенный rhMMP-2. Полученные смеси разводили в 5 раз буфером для анализа, после чего добавляли 50 мкл субстрата (концентрация 20 мкМ). Контроль для субстрата содержал буфер для анализа и субстрат. Регистрацию сигнала проводили в кинетическом режиме в течение 5 минут при длинах волн возбуждения 320 нм и испускания 405 нм (считывание сверху). В данных условиях единица активности определяется как количество фермента, обеспечивающее 50% ингибирование активности rhMMP-2 в минуту. Удельная активность TIMP3 составляет >6000 Ед/мг.